一种调控生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能的策略技术方案

本发明专利技术公开了一种调控生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能的策略，属于生物工程技术领域。本发明专利技术通过分子生物学手段，利用生物被膜，结合苯酚功能化修饰CdS纳米材料，达到提高电子传输。通过引入靶向生物被膜杂合系统，构建得到含有CdS

【技术实现步骤摘要】
一种调控生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能的策略


[0001]本专利技术涉及一种调控生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能的策略，属于生物工程


技术介绍

[0002]四碳二羧酸L
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苹果酸由于其舒适的酸度和柔软的口感被广泛应用于食品和饮料行业。此外，它还具有非食品应用，如制药、化妆品和常用的化学添加剂。美国能源部已将L
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苹果酸指定为最顶级的生物质化学品之一，有望获得更大的市场吸收和应用。
[0003]目前生产苹果酸的方法主要有(i)设计酿酒酵母中的丙酮酸羧化、草酰乙酸还原和L
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苹果酸转运系统以增加L
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苹果酸产量；(ii)在黑穗病菌TZ1中利用适应性实验室进化和培养基优化实现高细胞密度发酵来合成L
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苹果酸；(iii)工程酿酒酵母通过SpMae1(p)转运蛋白转运二羧酸，以增加L
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苹果酸产量；(iv)在大肠杆菌细胞膜上表面展示CdS纳米颗粒以吸收光能，转化成NADH用于L
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苹果酸生物合成过程中NADH再生。但是存在含量低、耗时长、污染大的问题。
[0004]以光驱动纳米材料为基础的生物杂合系统可以通过光照半导体纳米材料实现电子转移，进而改善胞内辅因子的水平。近年来将光照半导体光驱动纳米材料与生物催化代谢相结合的半人工光合作用系统以生物细胞高度成熟的代谢通路为基础，结合纳米光敏材料，可实现高附加值多碳化学品、清洁能源等物质在光能驱动下高效、高特异性的转化。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术通过结合生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能，提供一种高效生产苹果酸的基因工程菌，以及绿色高效的生产苹果酸的方法。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌表达碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK和苹果酸脱氢酶MDH；所述基因工程菌还表达耦联磷化铟(InP)或硫化镉(CdS)的卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA。
[0007]在一种实施方式中，编码所述卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码碳酸酐酶CA的基因cA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK的基因pck的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，编码苹果酸脱氢酶MDH的基因mdh的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0008]在一种实施方式中，所述编码碳酸酐酶的基因cA、编码磷酸烯醇式丙酮酸激酶的基因pck和编码苹果酸脱氢酶基因mdh受Pj23119组成型启动子、fic启动子、bolA启动子或S60启动子的调控。
[0009]在一种实施方式中，所述fic启动子、bolA启动子和S60启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
[0010]在一种实施方式中，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。
[0011]在一种实施方式中，所述大肠杆菌包括JM109和F0601。
[0012]在一种实施方式中，所述大肠杆菌F0601已公开于文章Dong,X 1,Chen,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli W3110 to produce L
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malate[J].Biotechnology and Bioengineering,2000.(doi:10.1002/bit.26190)
[0013]本专利技术的第二个目的是提供一种构建所述基因工程菌的方法，所述方法为先构建过表达苹果酸合成途径的质粒A与过表达卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA质粒B；随后将质粒A和质粒B共同转入宿主细胞，随后利用磷化铟(InP)或硫化镉(CdS)进行苯酚功能化修饰细胞。
[0014]在一种实施方式中，所述苹果酸合成途径包括碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK和苹果酸脱氢酶MDH。
[0015]在一种实施方式中，利用pJ01质粒过表达所述碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK、苹果酸脱氢酶MDH，利用pETac质粒过表达卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA。
[0016]在一种实施方式中，编码所述卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码碳酸酐酶CA的基因cA的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，编码磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK的基因pck的核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，编码苹果酸脱氢酶MDH的基因mdh的核苷酸序列为SEQ ID NO.4所示。
[0017]在一种实施方式中，所述pJ01质粒以质粒Petm6r1为基础，在rrnB T1终止子后插入T7Te终止子序列，去除sgRNA表达框，获得仅含有双终止子和Pj23119组成型启动子的质粒pJ01。
[0018]在一种实施方式中，所述pJ01的Pj23119组成型启动子还可替换为fic启动子、bolA启动子或S60启动子。
[0019]在一种实施方式中，所述fic启动子、bolA启动子和S60启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.5～7所示。
[0020]本专利技术的第三个目的是一种生产苹果酸的方法，所述方法为在光照条件下，利用上述基因工程菌发酵生产苹果酸。
[0021]在一种实施方式中，所述发酵的培养基包括NBS无机盐培养基。
[0022]在一种实施方式中，所述摇瓶发酵的条件为35
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38℃，200
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220rpm，菌株发酵初始OD
600
为0.04
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0.1，光照48～72h，发酵70
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75h。
[0023]在一种实施方式中，所述发酵罐发酵的条件为35
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38℃，480
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530rpm，菌株发酵初始OD
600
为35～45，装液量为30
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50％，pH为6.0
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7.0，光照48～72h，通气量为1
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2vvm，发酵80
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100h。
[0024]本专利技术的第四个目的是提供上述的基因工程菌或上述方法在制备苹果酸或下游衍生物中的应用。
[0025]本专利技术的第五个目的是提供上述的基因工程菌或上述的方法在生物、制药、食品或化工领域内的应用。
[0026]有益效果：
[0027]本专利技术提供了一种调控生物被膜杂合系统改善苹果酸生产性能的策略，构建有CdS
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生物杂合系统的菌株有效提高NADH浓度和苹果酸产量，在黑暗条件下，NADH浓度和NADH/NAD
+
比例分别降低了32％和39％，L
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苹果酸产量和生产强度分别增加到7.77g/L和0.11g/L/h，相比未利用CdS
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生物杂合系统的菌株，分别增加了27.38％和27.38％。
[002本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌表达碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK和苹果酸脱氢酶MDH；所述基因工程菌还表达耦联磷化铟(InP)或硫化镉(CdS)的卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA；编码卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；编码调控碳酸酐酶CA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，编码磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，编码苹果酸脱氢酶MDH基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。2.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述编码碳酸酐酶的基因cA、编码磷酸烯醇式丙酮酸激酶的基因pck和编码苹果酸脱氢酶基因mdh受Pj23119组成型启动子、fic启动子、bolA启动子或S60启动子的调控。3.根据权利要求1所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主。4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述大肠杆菌包括JM109和F0601。5.一种构建权利要求1～4任一所述基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法为先构建过表达苹果酸合成途径的质粒A与过表达卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA质粒B；随后将质粒A和质粒B共同转入宿主细胞，随后利用磷化铟或硫化镉进行苯酚功能化修饰细胞；所述苹果酸合成途径包括碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK和苹果酸脱氢酶MDH。6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，利用pJ01质粒过表达所述碳酸酐酶CA、磷酸烯醇式丙酮酸激酶PCK、苹果酸脱氢酶MDH，利用pETac质粒过表达卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA；编码卷曲纤毛纤维形成蛋白CsgA基因的核苷酸序列如SEQ ID N...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘立明，丁强，陈修来，高聪，胡贵鹏，郭亮，宋伟，刘佳，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：