一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术采用双启动子双信号肽Pcd

【技术实现步骤摘要】
一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，涉及一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段及其应用，特别涉及一种不同芽孢杆菌来源的启动子重组的双启动子和信号肽重组的双信号肽片段Pcd
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P43
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SamyQ
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SBsggt及其在制备丝氨酸蛋白酶(SplB)或谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ
‑
GT)中的应用。

技术介绍

[0002]酶制剂是一种具有专一性、高催化活性的生物催化剂，不仅在在生物研究
用途十分广泛，在食品、药品、护肤品等工业生产方面也深受偏爱。在传统生产方法中，人们经常采用从动物和植物的组织中分离提取获得酶，而目前通过微生物发酵的方式，由于其具有微生物种类多、繁殖快的特点，且产生的酶特异性强、pH适应性较广、稳定性较强、能胞外分泌，因此适合在工业中大量生产应用。此外，微生物产酶不受季节波动的限制，可在廉价的培养基上有规律的生长，因此与传统方法相比其生产过程更稳定，生产成本也更低，在工程菌株内表达异源蛋白逐渐成为发酵行业生产的热门途径。
[0003]枯草芽孢杆菌作为宿主，在人类食品酶的生产中有着悠久且安全的工业应用历史，被广泛认为是在许多食品中发现的一种无害污染物，不是人类病原体，也不产毒素。而一部分酶的来源微生物如金黄色葡萄球菌是一种能引起临床感染的常见致病菌，可导致皮肤和软组织感染和危及生命的侵袭性病理，如肺炎、骨髓炎、关节炎、心内膜炎和脓毒症等。枯草芽孢杆菌生产菌株是表达生产异源蛋白酶的安全菌株，使用基因编辑技术可使编码致病菌的酶的基因在枯草芽孢杆菌宿主内表达，满足安全生产要求。
[0004]当前工业应用上对蛋白的需求量日益增加，因此，研究如何通过改造载体上的关键元件——启动子和信号肽功能对于实现异源蛋白的高效表达具有重要意义。

技术实现思路

[0005]为了克服现有技术的缺点与不足，本专利技术的首要目的在于提供一种具有双重启动子功能的DNA片段。
[0006]本专利技术的另一目的在于提供一种具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段。
[0007]本专利技术的另一目的在于提供一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段。
[0008]本专利技术的再一目的在于提供上述DNA片段的应用。
[0009]本专利技术针对现有异源蛋白高表达的需求，提供一种双启动子表达系统，利用来源于枯草芽孢杆菌组成型强启动子P43和解淀粉芽孢杆菌强启动子Pcd进行融合得到双启动子Pcd
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P43的转录表达系统；提供一种双信号肽表达系统，利用来源于枯草芽孢杆菌淀粉酶信号肽SamyQ和GGT信号肽SBsGGT进行融合得到双信号肽SamyQ
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SBsGGT的转录表达系统；还
提供一种双启动子双信号肽表达系统，将上述双启动子Pcd
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P43的转录表达系统与双信号肽SamyQ
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SBsGGT的转录表达系统连接得到。
[0010]本专利技术还提供具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在质粒构建及其在异源金黄色葡萄球菌丝氨酸类蛋白酶B(SplB)及谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ
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GT)表达中的应用，能实现外源基因的高表达，为枯草芽孢杆菌表达外源基因提供了有效的元件。
[0011]本专利技术的目的通过下述技术方案实现：
[0012]一种不同芽孢杆菌来源的启动子重组的具有双重启动子功能的DNA片段，优选强启动子如解淀粉芽孢杆菌的启动子Pcd与枯草芽孢杆菌的启动子P43，所述DNA片段为如下任一序列：
[0013](a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补序列；
[0014](b)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或其互补序列。
[0015]所述的具有双重启动子功能的DNA片段在蛋白表达中的应用。
[0016]一种具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段，优选枯草芽孢杆菌来源的淀粉酶amyQ信号肽(SamyQ)和谷氨酰胺转肽酶GGT信号肽组成双信号肽SamyQ
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SBsGGT，所述氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列；
[0017]所述DNA片段为如下任一序列：
[0018](a)编码如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；
[0019](b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；
[0020](c)对如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或其互补序列。
[0021]所述具有双重分泌信号功能的氨基酸片段和相应的DNA片段在蛋白表达中的应用。
[0022]一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段，包括所述的具有双重启动子功能的DNA片段以及具有双重分泌信号功能的DNA片段(Pcd
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P43
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SamyQ
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SBsGGT)。
[0023]所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在蛋白表达中的应用。
[0024]一种双启动子通用载体，包含上述具有双重启动子功能的DNA片段的序列。
[0025]一种双启动子表达质粒，包含所述的包含上述具有双重启动子功能的DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
[0026]一种双启动子双信号肽通用载体，包含上述具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列；
[0027]一种双启动子双信号肽表达质粒，包含所述的包含上述具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段的序列以及与该序列可操作连接的位于该序列下游编码异源蛋白核苷酸序列。
[0028]所述的异源蛋白质核苷酸序列为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)编码的丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的核苷酸序列，或为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)编码的
谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ
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GT)的核苷酸序列。
[0029]所述丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
[0030]编码的丝氨酸类蛋白酶B(SplB)的核苷酸序列如SEQ ID NO.5中的1
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612bp所示。
[0031]所述谷氨酰胺转肽酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0032]编码的谷氨酰胺转肽酶(GGT或γ
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GT)的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种具有双重启动子功能的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段为如下任一序列：(a)如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列或其互补序列；(b)对如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列相同的作为启动子功能的核苷酸序列或其互补序列。2.一种具有双重分泌信号功能的氨基酸片段，其特征在于：所述氨基酸片段的序列如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列。3.编码权利要求2所述的具有双重分泌信号功能的氨基酸片段的DNA片段，其特征在于：所述DNA片段为如下任一序列：(a)编码如SEQ ID NO.4所示氨基酸序列的DNA片段；(b)如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列或其互补序列；(c)对如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列进行一个或多个核苷酸取代、缺失或添加所获得的，具有与如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列相同的作为信号肽功能的核苷酸序列或其互补序列。4.一种具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段，其特征在于：包括权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段以及权利要求3所述的DNA片段。5.权利要求1所述的具有双重启动子功能的DNA片段、权利要求2所述的具有双重分泌信号功能的氨基酸片段、权利要求3所述的DNA片段或权利要求4所述的具有双重启动子和双重分泌信号功能的组合DNA片段在蛋白表达中的应用。6.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：潘力，陈倩琳，王斌，辛青龙，
申请(专利权)人：华南理工大学，
类型：发明
国别省市：