甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶制造技术

本发明专利技术公开了一种甲基硫菌灵降解菌，其菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。本发明专利技术属于环保生物技术领域，本发明专利技术通过运用亲和层析技术，从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液中分离纯化得到该菌株降解甲基硫菌灵的甲基硫菌灵降解酶，在分离纯化得到甲基硫菌灵降解酶的基础上，运用固定化技术获得了可多次使用的固定化甲基硫菌灵降解酶，该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态果蔬产品中的甲基硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，对于环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】
甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固定化酶


[0001]本专利技术属于环保生物
，尤其涉及甲基硫菌灵降解菌、甲基硫菌灵降解酶及其固 定化酶。

技术介绍

[0002]甲基硫菌灵商品名称为甲基托布津，是一种具有内吸性强、低毒的强力杀菌剂，具有内 吸和预防病原菌的作用，能够有效防治蔬菜、花卉、果树、麦类等多种作物的病害，主要用 于烟草白粉病、番茄叶霉病、柑橘炭疽病等的防治。甲基硫菌灵的作用机理是：干扰病原菌 的有丝分裂中纺锤体的形成，使病菌孢子萌发长出的芽管扭曲异常，芽管细胞壁扭曲等，因 此病菌就不能正常生长，从而达到杀菌效果。
[0003]随着人们生活水平的不断提高，人们对食品的安全问题也是越来越重视。由于广泛、大 量和长期使用甲基硫菌灵，导致果蔬中该农药残留量严重超标，而食用农残超标的蔬菜水果 等食品产生的事故也屡见不鲜。农残仍是当今世界格外关注的一大食品安全问题，为有效控 制食品中的各种农药残留，各国家地区和组织机构不断完善农药管理制度及残留限量标准， 同时不断研发新型降低农残的技术。目前国内外用于农药残留降解的方法分为物理方法、化 学方法、微生物降解方法，其中物理方法主要有超声波技术、吸附等，化学方法主要有水解、 氧化分解和光化学降解等，生物降解方法主要有微生物、降解酶和工程菌等。微生物降解法 是大家公认的一种有效、廉价、无二次污染的方法，具有操作简便、繁殖快、生态恢复性好 等优点。迄今为止，各国科研人员已经从土壤、污泥、污水、天然水体、垃圾场和厩肥中分 离到降解多种农药的活性微生物。
[0004]现有技术已有甲基硫菌灵的降解菌筛选相关报道，马俊红,周厚发,雷丽萍,等发表了题为
ꢀ“
甲基硫菌灵降解菌的筛选与鉴定”的论文。然而，尚未发现有对菌株中降解酶分离纯化并固 定后应用于食品农残消除的报道。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术存在的问题，本专利技术以甲基硫菌灵为唯一碳源，从甲基硫菌灵污染土壤 中筛选出一株可以降解甲基硫菌灵的菌株，经鉴定后命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏 于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
[0006]亲和层析是一种分离纯化生物大分子尤其是蛋白质的一种极有效的方法，最大的特点是 具有很高的选择和分离性能以及较大的载量，并保持较高的活性，产率也高达75％以上。它 是根据不同蛋白质对特定配体的特异而非共价结合的能力不同进行蛋白质分离的，通过预分 离的样品时，对层析柱上的配基有亲和力的目标物质利用之间的疏水、氮键、静电、弱共价、 金属配位、结构互补等作用吸附在固相载体上，经洗脱得到目标物。
[0007]进一步地，本专利技术通过亲和层析技术及飞行质谱检测从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液 中分离纯化和鉴定了该菌株降解甲基硫菌灵的蛋白酶，并利用固定化技术获得了可多次使用 的固定化甲基硫菌灵降解酶。该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态
果蔬产品中的甲 基硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，对于环境保 护和保障公共卫生安全具有重要意义。
[0008]一个方面，本专利技术提供甲基硫菌灵降解菌，其菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保 藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
[0009]另一个方面，本专利技术还提供甲基硫菌灵降解酶，分离自所述甲基硫菌灵降解菌的发酵液， 属于二氢脂酰脱氢酶。
[0010]优选地，甲基硫菌灵降解酶，共含470个氨基酸，其氨基酸序列为：MVVGDFPIETDTLVIGAGPGGYVAAIRAAQLGQKVTVVEKATLGGVCLNVGCIPSKALINA GHRYENAKHSDDMGITAENVSVDFTKVQEWKASVVNKLTGGVAGLLKGNKVDVVKGEA YFVDSNSVRVMDENSAQTYTFKNAIIATGSRPIELPNFKYTERVLNSTGALALKEIPKKLVVI GGGYIGTELGTAYANFGTELVILEGGDEILPGFEKQMSSLVTRRLKKKGNVEIHTNAMAKG VEEKSDGVTVTFEVKGEEKTVDADYVLITVGRRPNTDELGLEQVGIEMTDRGVVKTDKQC RTNVPNIYAIGDIIEGPPLAHKASYEGKIAAEAIAGEPAEIDYLGIPAVVFSEPELASVGYTEA QAKEEGLDIVAAKFPFGANGRALSLNETDGFMKLITRKEDGLVIGAQIAGASASDMISELSL AIEGGMTAEDIAMTIHAHPTLGEITMEAAEVAIGSPIHIVK，即SEQ ID NO：1。
[0011]再一个方面，本专利技术还提供固定化甲基硫菌灵降解酶，其制备方法包括如下步骤：
[0012]1)将甲基硫菌灵降解酶酶粉用水复溶，制备成8～12mg/mL的酶溶液；
[0013]2)在38～42℃水浴中，配制2％～4％质量百分含量的海藻酸钠溶液，并加入所述酶溶液中， 搅拌均匀，得到酶
‑
海藻酸钠混合液；
[0014]3)在38～42℃水浴中，将壳聚糖溶于4％～6％质量百分含量的乙酸水溶液中，然后加入0.2～0.4 moL/L的CaCl2溶液，得到壳聚糖
‑
CaCl2混合液；在搅拌条件下，将所述酶
‑
海藻酸钠混合液 滴入所述壳聚糖
‑
CaCl2混合液中，反应完成后，过滤，得到圆球状固定化酶颗粒；
[0015]4)将所述圆球状固定化酶颗粒转移到0.2％～0.4％质量百分含量的戊二醛溶液中，交联，洗涤， 得到固定化甲基硫菌灵降解酶。
[0016]优选地，所述搅拌条件的转速为160～200rpm。
[0017]优选地，所述交联的条件为3～5℃、交联5～8h。
[0018]此外，本专利技术还提供固定化甲基硫菌灵降解酶在果蔬农残、废水农残的生物降解中的应 用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果包括：
[0020](1)本专利技术以甲基硫菌灵为唯一碳源，从甲基硫菌灵污染土壤中筛选出一株可以降解甲 基硫菌灵的菌株，经鉴定后命名为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏 中心，保藏编号为GDMCC No：61698。
[0021](2)本专利技术通过运用亲和层析技术，从甲基硫菌灵降解菌的发酵上清液中分离纯化得到 该菌株降解甲基硫菌灵的甲基硫菌灵降解酶，再运用飞行质谱检测确证其氨基酸序列，并进 行了三维建模结构分析。
[0022](3)在分离纯化得到甲基硫菌灵降解酶的基础上，运用固定化技术获得了可多次使用的 固定化甲基硫菌灵降解酶，该固定化甲基硫菌灵降解酶可更有效去除液态果蔬产品中的甲基 硫菌灵，达到超标果蔬农残生物降解的目的，也可应用于废水中农残的清除，产业化推广应 用价值高，对于环境保护和保障公共卫生安全具有重要意义。...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.甲基硫菌灵降解菌，其特征在于：其菌株名称为芽孢杆菌(Bacillus sp)J2，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61698。2.甲基硫菌灵降解酶，其特征在于：分离自权利要求1所述甲基硫菌灵降解菌的发酵液，属于二氢脂酰脱氢酶。3.根据权利要求2所述的甲基硫菌灵降解酶，其特征在于：共含470个氨基酸，其氨基酸序列为：MVVGDFPIETDTLVIGAGPGGYVAAIRAAQLGQKVTVVEKATLGGVCLNVGCIPSKALINAGHRYENAKHSDDMGITAENVSVDFTKVQEWKASVVNKLTGGVAGLLKGNKVDVVKGEAYFVDSNSVRVMDENSAQTYTFKNAIIATGSRPIELPNFKYTERVLNSTGALALKEIPKKLVVIGGGYIGTELGTAYANFGTELVILEGGDEILPGFEKQMSSLVTRRLKKKGNVEIHTNAMAKGVEEKSDGVTVTFEVKGEEKTVDADYVLITVGRRPNTDELGLEQVGIEMTDRGVVKTDKQCRTNVPNIYAIGDIIEGPPLAHKASYEGKIAAEAIAGEPAEIDYLGIPAVVFSEPELASVGYTEAQAKEEGLDIVAAKFPFGANGRALSLNETDGFMKLITRKEDGLVIGAQIAGASASDMISELSLA...

【专利技术属性】
技术研发人员：夏菠，张懿婷，易有金，庞立，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：