用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物制造技术

本文描述了包括重组腺相关病毒(rAAV)的组合物和试剂盒，这些组合物和试剂盒的向性显示出在靶细胞类型，例如大脑和肺中的特异性和病毒转导效率增加。本文所述的rAAV组合物的向性还显示出在脱靶细胞类型，例如肝脏中的特异性降低和病毒转导效率降低。本文所述的rAAV组合物使转基因，如治疗性核酸衣壳化。在全身递送到受试者后，与亲本或参考AAV相比，该rAAV能够增加该转基因在靶细胞类型中的特异性和转导。导。导。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于靶向基因疗法的腺相关病毒组合物
[0001]交叉引用
[0002]本申请要求于2018年9月26日提交的美国临时申请序列号62/736,904和于2019年4月11日提交的美国临时申请序列号62/832,812的权益，这两个申请通过全文引用的方式并入本文。
[0003]关于联邦政府资助的研究或开发的声明
[0004]本专利技术是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号NS087949和DARPA授予的授权号W91 INF
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0036在政府的支持下完成的。政府享有本专利技术的某些权利。
[0005]序列表
[0006]本申请含有已经以ASCII格式电子提交的序列表，并且特此以全文引用的方式并入。所述ASCII副本创建于2019年9月20日，被命名为38075
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733_601_SL.txt并且大小为10,656,833字节。

技术介绍

[0007]重组腺相关病毒(rAAV)由于其能够转导分裂细胞和非分裂细胞、能够以游离DNA的形式长期存在于受感染细胞中和低免疫原性而在基础科学研究和治疗性应用中越来越多地用于基因递送。这些特性使其对于在基础科学和临床方面的应用(如基因疗法)是有吸引力的。当前用于许多病症的基因治疗方法聚焦于直接递送，以增加转导效率并将表达仅限于受感染的细胞类型。然而，由于局部递送的覆盖范围有限，这种施用途径导致在许多临床试验和疾病方面的成功率有限。
[0008]静脉内施用解决了这些局限性，并且允许以非侵入性方式广泛且高效地接近全身的组织和器官。不幸的是，天然存在的血清型限制了某些细胞类型和器官的转导，而在其它细胞类型和器官中则具有非特异性、重叠的向性。这会在基因疗法应用中导致若干并发症，包含但不限于由于未受影响器官和细胞类型(具体地，肝脏)的转导而引起的脱靶效应，以及需要更大的病毒载量才能在所关注的组织或器官中达到足够的治疗水平。另外，即使是在全身性递送的情况下，目前的rAAV介导的基因疗法也缺乏对穿过血脑屏障(BBB)或上皮的特异性，从而限制了其作为用于大脑或器官(例如，肺)的疾病和病状的治疗性干预的可及范围)。
[0009]因此，需要当全身地(例如，静脉内、鼻内)递送到受试者时能够实现对靶特定细胞类型或器官的高特异性和对未受影响的(脱靶)器官和细胞类型的低特异性的rAAV。

技术实现思路

[0010]本文公开了重组AAV(rAAV)，这些rAAV包括具有特异性的衣壳，这些衣壳通过正向和负向选择的迭代轮次而工程化到衣壳结构中。该工程化产生了rAAV变体，该rAAV变体相对于其所衍生自的未经修饰的亲本衣壳对某些组织或器官的特异性改变。在一些实施例中，该rAAV变体包括AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白在与AAV9衣壳蛋白VP1的氨基酸452
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458
相对应的残基处具有7聚体肽取代。在某些实施例中，该取代是AAV9 VP1的氨基酸452
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458的取代。在某些其它实施例中，该取代是AAV
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PHP.B VP1的氨基酸452
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458的取代。在又其它实施例中，该取代是AAV
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PHP.eB VP1的氨基酸452
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458的取代。在一些实施例中，该取代降低了rAAV衣壳对细胞或组织的向性，使该rAAV变体能够减少治疗性病毒转导的脱靶效应，从而消除了对更大病毒剂量的需求。在一些实施例中，该取代增加了rAAV衣壳对细胞或组织的向性，使该rAAV变体在全身性递送(例如，静脉内注射)时能够实现向受试者中的靶环境(例如，靶细胞类型或组织)的广泛转导。通常，该7聚体肽取代不是ILGTGTS(SEQ ID NO:45479)、QSSQTPR(SEQ ID NO:45479)或TLAVPFK(SEQ ID NO:45477)。
[0011]本文描述的rAAV是使用基于Cre重组的AAV靶向进化(CREATE)方法的修改版本鉴定的。多重CREATE(M
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CREATE)方法通过在衣壳蛋白序列中引入变异、无偏的体内选择和仅回收行进到限定的细胞群体、跨细胞膜、行进到细胞核并解包并表达其基因有效载荷的那些变体来产生增强的转导效率和/或特异性。回收并通过深度测序鉴定表现出最期望的向性(例如，对特定体内环境的增强的效率和特异性)的变体衣壳。用于无偏选择和分析的策略包含确定变体的富集评分(通过将靶组织文库相对于起始病毒文库归一化)和通过合成文库构建在选择轮次之间的无偏传播(其中每个变体等同地表示)。本文还描述了来自测序数据的所得文库的详细表征，其提供了关于针对靶标的变体的选择的有用见解。
[0012]本文还公开了AAV衣壳文库，该AAV衣壳文库包括AAV衣壳蛋白，该AAV衣壳蛋白在与AAV9 VP1的氨基酸452
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458相对应的残基处具有7聚体肽取代。在一些实施例中，该文库是在AAV9变体AAV
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PHP.eB或AAV
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PHP.B的氨基酸452
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458处包括7聚体肽取代的衣壳的文库。此类文库在跨不同脑细胞类型(例如，内皮细胞、神经元和星形胶质细胞)的体内正向选择和跨肝脏的负向选择中具有特殊用途，本文已表明此类文库可以产生穿过BBB、广泛转导中枢神经系统(CNS)以及使脱靶体内环境(例如，肝脏)去靶的能力得到增强的AAV9变体的大集群。在其它实施例中，该文库是包括AAV衣壳蛋白的AAV衣壳文库，该AAV衣壳蛋白在AAV9的氨基酸452
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458处具有7聚体肽取代。此类文库在跨如脊髓、大脑、肝脏、胃、肠、肺、心脏、睾丸、脾脏、动物脂肪(脂肪)和肌肉等不同器官的体内选择中具有特殊用途。
[0013]本文还公开了用于产生治疗性重组AAV(rAAV)颗粒的方法和试剂盒，以及用于治疗有需要的受试者的影响例如CNS、PNS或靶体内环境(例如，肺)的疾病或病状的方法和包括该rAAV颗粒的药物组合物或调配物。
[0014]本文公开的方面提供了重组AAV(rAAV)，该rAAV包括：(a)变体AAV衣壳，该变体AAV衣壳包括变体AAV衣壳蛋白，该变体AAV衣壳蛋白包括对应的亲本AAV衣壳蛋白的3重对称轴处的7聚体肽序列内的三个或更多个氨基酸的氨基酸取代，其中该7聚体肽序列位于与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452
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458相对应的氨基酸位置处，并且其中该氨基酸取代不是ILGTGTS(SEQ ID NO:45479)、QSSQTPR(SEQ ID NO:45479)或TLAVPFK(SEQ ID NO:45477)；以及(b)异源多核苷酸，该异源多核苷酸包括编码基因产物的核苷酸序列。在一些实施例中，当在受试者中测量时，相对于对应的亲本AAV衣壳的向性，该变体AAV衣壳对靶组织或靶细胞的向性增加。在一些实施例中，该靶组织或该靶细本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种重组AAV(rAAV)，其包括：a)变体AAV衣壳，所述变体AAV衣壳包括变体AAV衣壳蛋白，所述变体AAV衣壳蛋白包括对应的亲本AAV衣壳蛋白的3重对称轴处的7聚体肽序列内的三个或更多个氨基酸的氨基酸取代，其中所述7聚体肽序列位于与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452
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458相对应的氨基酸位置处，并且其中所述氨基酸取代不是ILGTGTS(SEQ ID NO:45479)、QSSQTPR(SEQ ID NO:45479)或TLAVPFK(SEQ ID NO:45477)；以及b)异源多核苷酸，所述异源多核苷酸包括编码基因产物的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的rAAV，其中当在受试者中测量时，相对于所述对应的亲本AAV衣壳的向性，所述变体AAV衣壳对靶组织或靶细胞的向性增加。3.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述靶组织或所述靶细胞包括中枢神经系统(CNS)或外周神经系统(PNS)或其组合的组织或细胞。4.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中当在受试者中测量时，相对于对应的亲本AAV衣壳的向性，所述变体AAV衣壳对包括肝组织的脱靶组织或包括肝细胞的脱靶细胞的向性降低。5.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述三个或更多个氨基酸包括所述亲本AAV衣壳蛋白中与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452
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454、453
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455、454
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456、455
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457或456
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458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：A、D、E、G、K、H、M、N、P、L、Q、S、T和V。6.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述三个或更多个氨基酸包括所述亲本AAV衣壳蛋白中与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452
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455、453
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456、454
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457或455
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458相对应的氨基酸位置处的四个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：A、D、E、G、K、H、M、N、P、L、Q、S、T和V。7.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中三个或更多个氨基酸包括所述亲本AAV衣壳蛋白中与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452
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456、453
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457或454
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458相对应的氨基酸位置处的至少五个连续氨基酸，每个氨基酸独立地选自由以下组成的组：A、D、E、G、K、H、M、N、P、L、Q、S、T和V。8.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述三个或更多个氨基酸包括以下中的三个或更多个：a)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452相对应的氨基酸位置处取代的A、D、E、G、H、M、N、Q、S、T或V；b)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基453相对应的氨基酸位置处取代的A、D、E、G、K、N、Q、S、T或V；c)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基454相对应的氨基酸位置处取代的A、D、E、G、K、N、Q、S、T或V；d)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基455相对应的氨基酸位置处取代的A、D、E、G、K、N、P、Q、S或T；e)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基456相对应的氨基酸位置处取代的A、D、E、G、H、K、N、P、Q、S或T；f)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基457相对应的氨基酸位置处取代的A、D、
E、G、K、N、P、S、T或V；以及g)在与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基458相对应的氨基酸位置处取代的A、E、G、H、K、L、N、Q、S、T或V。9.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述氨基酸取代包括选自DGAATKN(SEQ ID NO:3943)和DGQSSKS(SEQ ID NO:2764)的氨基酸序列。10.根据权利要求4所述的rAAV，其中所述三个或更多个氨基酸包括以下中的三个或更多个：a)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基452相对应的位置处的氨基酸处取代的A、D、G、L、N、Q、S或T；b)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基453相对应的位置处的氨基酸处取代的A、G、N、P、Q、R、S或；c)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基454相对应的位置处的氨基酸处取代的A、D、G、N、S或T；d)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基455相对应的位置处的氨基酸处取代的A、D、G、K、N、P、Q、S或T；e)与AAV9 VP(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基456相对应的位置处的氨基酸处取代的A、G、K、N、P、R、S或T；f)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基457相对应的位置处的氨基酸处取代的A、G、K、N、P、R、S、T或V；以及g)与AAV9 VP1(SEQ ID NO:1)的氨基酸残基458相对应的位置处的氨基酸处取代的A、G、K、L、R、S、T或V。11.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述氨基酸取代包括选自由以下组成的组的氨基酸序列：LQTSSPG(SEQ ID NO:2933)、QQGKQSV(SEQ ID NO:79)、SINTKTN(SEQ ID NO:45475)、SNGTKQT(SEQ ID NO:442)、GSGKTAA(SEQ ID NO:88)、MGDKPTR(SEQ ID NO:2466)、QPSGGNT(SEQ ID NO:2672)、ERGANTK(SEQ ID NO:5192)、TTGGHSS(SEQ ID NO:2743)、GTTKTSE(SEQ ID NO:3064)、GTGTSVL(SEQ ID NO:11958)、NQSGTKG(SEQ ID NO:780)、KGPGQMG(SEQ ID NO:45476)和GTPSKAG(SEQ ID NO:2741)。12.根据权利要求2到11中任一项所述的rAAV，其中所述靶组织或所述组织中的所述靶细胞选自由以下组成的组：肺、肠、肾脏、心脏和胃。13.根据前述权利要求中任一项所述的rAAV，其中所述三个或更多个氨基酸包括与AAV9 VP1的氨基酸残基452
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454、453
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455、454
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456、455
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457或456
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458相对应的氨基酸位置处的三个连续氨基酸，其中：a...

【专利技术属性】
技术研发人员：维维安娜，
申请(专利权)人：加州理工学院，
类型：发明
国别省市：