一株耐受L-高丝氨酸的大肠杆菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株耐受L

【技术实现步骤摘要】
一株耐受L
‑
高丝氨酸的大肠杆菌及其应用


[0001]本专利技术涉及生物
，特别涉及一株耐受L
‑
高丝氨酸的大肠杆菌及其应用。

技术介绍

[0002]L
‑
高丝氨酸是非蛋白原性氨基酸，是重要的L
‑
天冬氨酸族衍生的必需氨基酸(如L
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蛋氨酸、L
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苏氨酸和L
‑
异亮氨酸)的合成前体。L
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高丝氨酸已经在食品、医药、化妆品、农业和动物饲料工业方面显示出巨大的潜在应用前景。此外，L
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高丝氨酸是一种很有前途的平台化合物，可以用来生产如O
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乙酰高丝氨酸、邻琥珀酰
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L
‑
高丝氨酸、1,3
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丙二醇、异丁醇和γ
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丁内酯等精细化学品。因此，它引起了人们极大的兴趣，市场需求不断增加。目前，L
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高丝氨酸的主要生产方法主要有三种：化学法、酶催化和微生物发酵。微生物发酵法因其成本低、条件温和、绿色环保等优点越来越受到重视。目前有文章报道的微生物发酵法，主要使用的宿主是大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌。
[0003]通过敲除代谢竞争途径，改变代谢通量，谷氨酸棒杆菌可以生产8.8g/L L
‑
高丝氨酸(Li N,Xu S,Du G,et al.Efficient production ofL
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homoserine in Corynebacterium glutamicumATCC13032by redistribution ofmetabolic flux.Biochemical Engineering Journal,2020,161:107665)。利用大肠杆菌作为宿主生产L
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高丝氨酸的文献报道较多，基于细胞内天冬氨酸的合成途径，经过发酵优化，文献报道的L
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高丝氨酸产量在48h达到60.1g/L，发酵强度1.25g/L/h(Zhang Y,Wei M,Zhao G,etal.High
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level production of L
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homoserine using a non
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induced,non
‑
auxotrophic Escherichia coli chassisthrough metabolic engineering,Bioresource Technology,2021,doi:https://doi.org/10.1016/j.biortech.2021.124814)，这是目前文献报道的最高产量和发酵强度。现有报道存在转化率低，高丝氨酸耐受差，产量不够高，不利于规模化低成本生产等等缺点。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的是提供一株耐受L
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高丝氨酸且能够高产L
‑
高丝氨酸的大肠杆菌及其应用。
[0005]第一方面，本专利技术要求保护一株耐受L
‑
高丝氨酸的大肠杆菌。
[0006]本专利技术要求保护的耐受L
‑
高丝氨酸的大肠杆菌具体为大肠杆菌HS02。所述大肠杆菌HS02为以大肠杆菌BW25113作为出发菌株，经过ARTP诱变传代培养，筛选得到的能够耐受高浓度L
‑
高丝氨酸生长的菌株，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.21837。
[0007]第二方面，本专利技术要求保护一种重组菌。
[0008]本专利技术所要求保护的重组菌是通过改造底盘宿主菌中的代谢途径1和代谢途径2，使两条代谢途径的代谢通量(0.8
‑
1.2):1(优选1:1)匹配后得到的重组菌。
[0009]所述代谢途径1为：从草酰乙酸合成天冬氨酸，再经天冬氨酸合成L
‑
高丝氨酸；
[0010]所述代谢途径2为：从富马酸合成天冬氨酸，再经天冬氨酸合成L
‑
高丝氨酸。
[0011]所述底盘宿主菌为在具有L
‑
高丝氨酸耐受性且具有天冬氨酸到苏氨酸通路的出发细菌中进行如下a1)
‑
a8)所示全部改造(其他基因不变)后得到的菌：
[0012]a1)降低所述出发细菌中DNA结合转录抑制因子lacI的活性或其编码基因的表达量；
[0013]a2)降低所述出发细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶metA的活性或其编码基因的表达量；
[0014]a3)降低所述出发细菌中二氨基庚酸脱羧酶lysA的活性或其编码基因的表达量；
[0015]a4)降低所述出发细菌中的高丝氨酸激酶thrB的活性或其编码基因的表达量；
[0016]a5)降低所述出发细菌中的可溶性吡啶核苷酸转移酶sthA的活性或其编码基因的表达量；
[0017]a6)提高所述出发细菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc的活性或其编码基因的表达量；
[0018]a7)提高所述出发细菌中吡啶核苷酸转移酶pntAB的活性或其编码基因的表达量；
[0019]a8)降低所述出发细菌中的乙醛酸途径抑制蛋白iclR的活性或其编码基因的表达量。
[0020]在本专利技术的具体实施方式中，所述a1)具体为敲除所述出发细菌中的所述DNA结合转录抑制因子lacI的编码基因(简称lacI基因)；所述a2)具体为敲除所述出发细菌中的所述高丝氨酸琥珀酰转移酶metA的编码基因(简称metA基因)；所述a3)具体为敲除所述出发细菌中的所述二氨基庚酸脱羧酶lysA的编码基因(简称lysA基因)；所述a4)具体为敲除所述出发细菌中的所述高丝氨酸激酶thrB的编码基因(简称thrB基因)；所述a5)具体为敲除所述可溶性吡啶核苷酸转移酶sthA的编码基因(简称sthA基因)；所述a6)具体为向所述出发细菌中导入所述磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc的编码基因(简称ppc基因)；所述a7)具体为向所述出发细菌中导入所述吡啶核苷酸转移酶pntAB的编码基因(简称pntAB基因)；所述a8)具体为敲除所述出发细菌中的所述乙醛酸途径抑制蛋白iclR的编码基因(简称iclR基因)。
[0021]在本专利技术的具体实施方式中，所述底盘宿主菌为敲除所述出发细菌基因组中的lacI基因、metA基因、lysA基因、iclR基因，且将thrB基因替换为Trc
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ppc(由Trc启动子启动表达的ppc基因)，且将sthA基因替换为Trc
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pntAB(由Trc启动子启动表达的pntAB基因)，其他基因序列不变，得到的菌。
[0022]其中，所述DNA结合转录抑制因子lacI的氨基酸序列为(genbank号及提交日NP_414879.3，提交日20181011)，对应的编码基因序列为Gene ID:945007。所述高丝氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.大肠杆菌HS02，其在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCC No.21837。2.重组菌，其特征在于：所述重组菌是通过改造底盘宿主菌中的代谢途径1和代谢途径2，使两条代谢途径的代谢通量(0.8
‑
1.2):1匹配后得到的重组菌；所述代谢途径1为：从草酰乙酸合成天冬氨酸，再经天冬氨酸合成L
‑
高丝氨酸；所述代谢途径2为：从富马酸合成天冬氨酸，再经天冬氨酸合成L
‑
高丝氨酸；所述底盘宿主菌为在具有L
‑
高丝氨酸耐受性且具有天冬氨酸到苏氨酸通路的出发细菌中进行如下a1)
‑
a8)所示全部改造后得到的菌：a1)降低所述出发细菌中DNA结合转录抑制因子lacI的活性或其编码基因的表达量；a2)降低所述出发细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶metA的活性或其编码基因的表达量；a3)降低所述出发细菌中二氨基庚酸脱羧酶lysA的活性或其编码基因的表达量；a4)降低所述出发细菌中的高丝氨酸激酶thrB的活性或其编码基因的表达量；a5)降低所述出发细菌中的可溶性吡啶核苷酸转移酶sthA的活性或其编码基因的表达量；a6)提高所述出发细菌中磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶ppc的活性或其编码基因的表达量；a7)提高所述出发细菌中吡啶核苷酸转移酶pntAB的活性或其编码基因的表达量；a8)降低所述出发细菌中的乙醛酸途径抑制蛋白iclR的活性或其编码基因的表达量。3.重组菌，其特征在于：所述重组菌是通过对所述底盘宿主菌进行如下b1)和b2)中至少b2)所示改造后实现：b1)加强所述底盘宿主菌中的天冬氨酸到高丝氨酸代谢途径；b2)向所述底盘宿主菌中导入天冬氨酸氨基裂解酶aspA的编码基因，以及天冬氨酸氨基转移酶aspC的编码基因和谷氨酸脱氢酶gdhA的编码基因；并使所述天冬氨酸氨基裂解酶aspA的编码基因在强度为2800AU的RBS序列的调控下进行表达，使所述天冬氨酸氨基转移酶aspC的编码基因在强度为3600AU的RBS序列的调控下进行表达，使所述谷氨酸脱氢酶gdhA的编码基因在强度为1000AU的RBS序列的调控下进行表达；所述底盘宿主菌为在具有L
‑
高丝氨酸耐受性且具有天冬氨酸到苏氨酸通路的出发细菌中进行如下a1)
‑
a8)所示全部改造后得到的菌：a1)降低所述出发细菌中DNA结合转录抑制因子lacI的活性或其编码基因的表达量；a2)降低所述出发细菌中高丝氨酸琥珀酰转移酶metA的活...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟庆璇，毛贤军，陶勇，于波，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：