一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原及其应用技术

本发明专利技术涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒制备方法，该方法将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因经重组到pETSUMO载体，与SUMO形成融合蛋白基因，扩增三个融合蛋白基因后，克隆入同一pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1，将表达载体转化到大肠杆菌中表达融合蛋白，表达的融合蛋白在10U/mL Ulp1蛋白酶浓度条件下，酶切去除SUMO，VP0、VP3、VP1蛋白自我组装形成O型口蹄疫病毒样颗粒。该方法高效制备O型口蹄疫病毒样颗粒，适于产业上大规模生产。适于产业上大规模生产。适于产业上大规模生产。

【技术实现步骤摘要】
一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和病毒学领域。本专利技术具体涉及一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法、制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原及其应用。

技术介绍

[0002]口蹄疫(Foot-and-mouth disease，FMD)为一种急性、高度接触传染性和可快速远距离传播的动物疾病，是哺乳动物中感染性最强的疾病，其中偶蹄类动物染病更会造成全球重大的经济损失。遭受口蹄疫危害的动物包括牛，羊、山羊和猪。致病因子，口蹄疫病毒(Foot-and-mouthdisease virus，FMDV)，是小核糖核酸病毒属家族的一种口疮病毒。该病毒分为7个血清型(A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型)，其中O型FMDV流行最为广泛。疫苗免疫是控制此病、保护家畜免受危害的有效措施。传统的疫苗包括灭活疫苗和减毒疫苗，他们虽然具有较好的免疫原性，也确实在FMD的预防和控制中起到了非常重要的作用。但是也存在以下几个缺点：1、病毒必须在高度密封的设备中生产，以防止污染周围环境；生产过程中，病毒有可能没有完全杀死或充分减毒，会导致疫苗中含有高毒性致病物质，进而导致被免疫动物发病而使疾病大规模流行。2、有效期很短，而且常常需要冷冻保存，这增大了疫苗在农村推广使用的难度。3、灭活疫苗免疫与感染FMDV的动物区分不开，限制了动物出口。4、生产依赖于FMDV，所以不能彻底消灭 FMDV。目前使用的灭活疫苗和减毒疫苗防控已不能适应当前畜牧业的健康发展。/>[0003]病毒样颗粒(virus-like particles，VLPs)是一种在体外和/或体内表达时能够自组装成病毒外壳结构的类病毒粒子，它们是具有病毒的相似外壳结构但是不具有病毒复制能力的假病毒。VLPs疫苗能有效地激发机体产生抗感染，抗肿瘤免疫，基于病毒样颗粒设计的疫苗是一种较为理想的疫苗形式，然而病毒样颗粒的组装效率直接影响病毒样颗粒疫苗的免疫效力。
[0004]因此，FMDV VLPs的组装和调控机制对于FMDV的相关研究和 FMDV疫苗的生产具有重要的理论和实际指导意义，现实生产中需要对抗原制备中病毒样颗粒组装的效率和影响因素进行研究，以指导工业化生产。

技术实现思路

[0005]为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因分别重组到不同的pETSUMO 载体，得到重组载体，以所述重组载体为模板，分别扩增 RBS-SUMO-VP0片段、T7-RBS-SUMO-VP3片段和T7-RBS-SUMO-VP1 片段，所述扩增的片段分别酶切，所述酶切的片段依次克隆入同一 pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a
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SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1；步骤(2)将所述重组表达载体 pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1转化到大肠杆菌，串联表达SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白，纯化所述 SUMO-VP0、
SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白；以及步骤(3)将所述纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白总蛋白浓度调节至1.0mg/mL，在所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1 融合蛋白的溶液中添加10U/mL Ulp1蛋白酶，孵育，然后去除酶切产生的SUMO蛋白，得到自我组装的所述O型口蹄疫病毒样颗粒。
[0006]本专利技术通过实验阐明了FMDV VLPs的组装机制，并在此基础上提供了一种用于将FMDV衣壳蛋白或其变体组装成VLPs的方法，即提供了新的制备FMDV VLPs的方法。本专利技术的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法通过控制SUMO标签的切除速率，进而控制FMDV VLPs的组装进程，从而实现了最好的MDV VLPs的组装效率。
[0007]本专利技术的制备方法选择的串联表达载体还可以是pET28b、pET32a；所述步骤(2)的大肠杆菌还可以是为E.coli BL21(DE3)、Origami B(DE3) pLysS、Rosetta-gami B(DE3)。
[0008]根据本专利技术，大肠杆菌(菌株)来源于市场上可得到的菌株，例如但不限于：GI698，ER2566，BL21(DE3)，B834(DE3)，BLR(DE3)。
[0009]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(1)中所述O型口蹄疫病毒VP0基因如SEQ ID NO.1或其简并序列所示；所述O型口蹄疫病毒 VP3基因如SEQ ID NO.2或其简并序列所示；以及所述O型口蹄疫病毒VP1基因如SEQ ID NO.3或其简并序列所示。
[0010]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(2)中所述大肠杆菌的菌株为BL21(DE3)，所述纯化为采用硫酸铵分级沉淀法进行粗纯，随后进行色谱纯化。
[0011]本专利技术通过选择串联表达载体和宿主菌，对VP0、VP3、VP1抗原蛋白进行串联表达，利于后续的抗原分离、纯化，简化了程序。表达、纯化和自我组装成为病毒样颗粒的可溶性蛋白具有生物活性。
[0012]作为本专利技术的一种优选实施方式，本专利技术所述的方法中，所述步骤 (2)中在宿主细胞扩增后，加入IPTG，诱导所述蛋白表达。
[0013]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(3)中所述蛋白溶液为 20mM磷酸氢二钠缓冲液，pH值为7.0-8.0，其中含有0.3-0.5M的 (NH4)2SO4，15℃孵育24h，然后加入镍填料吸附去除SUMO蛋白。
[0014]作为本专利技术的一种实施方式，所述步骤(3)中所述蛋白溶液中含有0.5M的(NH4)2SO4，所述蛋白溶液pH为8.0，15℃孵育24h。6、根据权利要求1～5任一项所述的制备方法制备的O型口蹄疫病毒样颗粒抗原。
[0015]本专利技术的制备方法通过控制SUMO标签的切除速率，适宜的温度条件下，在特定病毒样颗粒自我组装溶液中，提高了病毒样颗粒的组装效率，病毒样颗粒稳定，该方法可以适用于制备不同血清型的口蹄疫病毒样颗粒。
[0016]本专利技术的制备方法制备的口蹄疫病毒样颗粒，可溶性表达产量高、生产成本低、该口蹄疫病毒样颗粒稳定、免疫原性好、无生物安全风险。
[0017]本专利技术的制备方法还可用于制备A型、Asia1型口蹄疫病毒样颗粒抗原。本专利技术还涉及一种疫苗组合物，其中，所述疫苗组合包含免疫量的所述O型口蹄疫病毒样颗粒抗原和药学上可接受的载体。
[0018]作为本专利技术的一种实施方式，所述O型口蹄疫病毒样颗粒含量为 100～200μg/ml。
[0019]本专利技术的口蹄疫病毒样颗粒疫苗组合物中口蹄疫病毒样颗粒抗原含量可以任意选自100μg/ml、110μg/ml、120μg/ml、130μg/ml、140μg/ml、 150μg/ml、160μg/ml、170μ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种O型口蹄疫病毒样颗粒抗原制备方法，其中，所述制备方法包括：步骤(1)将O型口蹄疫病毒VP0基因、VP3基因、VP1基因分别重组到不同的pETSUMO载体，得到重组载体，以所述重组载体为模板，分别扩增RBS-SUMO-VP0片段、T7-RBS-SUMO-VP3片段和T7-RBS-SUMO-VP1片段，所述扩增的片段分别酶切，所述酶切的片段依次克隆入同一pET28a表达载体，得到重组的表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1；步骤(2)将所述重组表达载体pET28a-SUMO-VP0-SUMO-VP3-SUMO-VP1转化到大肠杆菌，串联表达SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白，纯化所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白；以及步骤(3)将所述纯化的SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白总蛋白浓度调节至1.0mg/mL，在所述SUMO-VP0、SUMO-VP3和SUMO-VP1融合蛋白的溶液中添加10U/mL Ulp1蛋白酶，孵育，然后去除酶切产生的SUMO蛋白，得到自我组装的所述O型口蹄疫病毒样颗粒。2.根据权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤(1)中所述O型口蹄疫病毒VP0基因如SEQ ID NO.1或其简并序列所示；所述O型口蹄疫病毒VP3基因如SEQ ID NO.2或其简并序列所示；以及所述O型口蹄疫病毒VP1基因如SEQ...

【专利技术属性】
技术研发人员：田克恭，张素玲，张许科，
申请(专利权)人：普莱柯生物工程股份有限公司，
类型：发明
国别省市：