一种制备双链RNA的方法技术

本发明专利技术属于核酸技术领域，具体涉及一种制备双链RNA的方法，主要解决现有双链RNA制备方法步骤繁琐、效率低、成本高昂且难以实现大量制备的问题。针对要制备的双链RNA，先设计一个含有长度为5

【技术实现步骤摘要】
一种制备双链RNA的方法


[0001]本专利技术属于核酸
，具体涉及一种制备双链RNA的方法。

技术介绍

[0002]双链RNA（dsRNA）结构在自然界中普遍存在，其常作为长链RNA，如核糖体RNA（rRNA）、信使RNA（mRNA）以及类病毒（一种仅由RNA组成的病毒）等的一小部分。长度为几百~几千个碱基对的长双链RNA，如pre
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miRNA（其由mRNA的一部分和与其互补的RNA链组成）和双链RNA病毒等也被发现广泛存在。其中最有前景的应用之一是以小干扰RNA（small interfering RNAs，siRNAs）为工具来发挥作用的RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术，其是用于转录后基因调控的有力工具（Nature Genet,2002,32,107
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108；EMBO J,2001,20,6877
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6888；Proc Natl Acad Sci USA,2002,99,9942
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9947.）。近年来RNAi技术被尝试应用于农业（病虫害防治）（Insect Sci,2013,20,4
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14；Pest Manag Sci,2016,72,801
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809）和水产养殖业（虾病防治）（J Biotechnol,2020,321,48
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56；J Virol Methods,2013,188,64
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69；IOP Conf Ser Earth Environ Sci,2020,584,012051.）中。但目前dsRNA的大量、高效合成尚未实现，这在很大程度上制约了RNAi农（渔）药、RNAi疫苗的推广使用。因此，亟需建立一种可满足dsRNA高效、低成本、简易制备的方法，以满足科研需求和市场需求。
[0003]dsRNA在体内/外均可制备（Anal Bioanal Chem,2018,410,3239
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3252）。体内制备（重组过表达）时需要先将用于转录的模板重组到质粒载体当中，然后将其导入大肠杆菌（E.coli）（J. Biotechnol,2020,321,48
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56；J Virol Methods,2013,188,64
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69；IOP Conf.Ser.Earth Environ Sci,2020,584,012051.）、植物细胞（UK Patent,No.WO2020183416
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A1,Sep17,2020）或哺乳动物细胞（Methods Mol Biol,2013,942,291
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314.）中进行诱导培养。整个过程需经历表达载体构建、转染、细胞培养、裂解、产物提取纯化（需去除宿主自身的rRNA等杂质）等诸多步骤，较为繁琐；并且胞内机质复杂，产物易被核酸酶降解的同时生物安全性也难以保证。目前这些体内制备技术尚处于研究阶段，未被用于实际生产。
[0004]体外制备方法可分为化学合成和酶法合成（转录）两大类。化学合成法（固相合成）存在合成步骤繁琐（EMBO J,2001,20,6877
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6888；Nat Struct Biol,1998,5,203
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212；Isr J Chem,2013,53,326
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349）、产物纯度较差（Anal Biochem,2001,298,196
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206；Chin J Biotech,2018,34,664）、难以实现大量合成、生物安全性较差（使用多种有机试剂）（Chin J Biotech,2018,34,664）等诸多缺陷。相较化学合成而言，酶法因在液相环境中进行而更易于实现大规模生产，且由于在整个过程中没有涉及到有害有机试剂，因此产品的安全性更好（Isr J Chem,2013,53,326
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349；Chimia,2005,59,812
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816）。近些年的研究还表明酶法可满足带修饰RNA的合成，发展前景良好（Org Biomol Chem,2018,16,5800
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5807；Molecules,2020,25,5492）。按照模板为线性还是环状，现有dsRNA酶法合成方法可分为线性转录和滚环转录。线性转录可分为两种情况，一种是用两种线性双链DNA模板分别转录出sense链和antisense链，然后退火杂交获得dsRNA（Nucleic Acids Res,2002,30,e46；
Nucleic Acids Res,2003,31,e38）；另一种是直接用含有回文序列的线性双链DNA模板制备得到同时含有sense序列和antisense序列的发卡型结构的RNA，再由体内的Dicer酶加工处理得到目标siRNA（Mol Biotechnol,2017,59,73
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83）。上述两种方法中所用到的线性双链DNA模板中均包含启动子序列，且为了能高效起始转录，有些模板中启动子下游的最初两个碱基须为GG，要想得到精确的产物，后续需酶切去除多余转录出的CC（Nucleic Acids Res,2003,31,e38）。由此可见上述线性转录法均较繁琐，且效率低下，难以满足实际应用需求。相较线性转录而言，滚环转录的效率要高出许多。现有滚环转录法也可分为两类。一类是直接用一个环状单链DNA（哑铃环（Oligonucleotides,2006,16,353
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363）或“Y”型单环（Nano Lett,2018,18,4279
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4284））同时转录出sense序列和antisense序列。这种方法虽较简便，但需对模板进行加长设计，这样就会额外转录出无用序列，需后续纯化。还有一类是用两种环状单链DNA分别转录出sense序列和antisense序列，再退火杂交得到目的dsRNA（Sci Rep,2017,7,10005；Adv Sci (Weinh),2017,4,1600523）。采用这种方法时，由于环状单链DNA的转录效率易受模板序列和自身二级结构的影响（J Am Chem Soc,1995,117,7818
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7819；Proc Natl Acad Sci USA,2002,99,54
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59；Nucl Acids Res,2013,41,2552
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2564；Nucl Acids Res,2014,42,10596
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10604；Science Advance Today,2015,25226.），可能会发生不对称转录（一个环状单链DNA转录效率高，一个转录效率低），使得产物为dsRNA和ssRNA（单链RNA）的混合物。由此可见现有方法均难以实现dsRNA的大量、高效合成。

技术实现思路

[0005]针对现有双链RNA制备方法步骤繁琐、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种制备双链RNA的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一，设计并制备环状双链DNA模板，所述环状双链DNA模板含有非互补的泡状结构部分和互补部分，不含启动子序列，所述互补部分与要制备的双链RNA长度相同且序列相同，序列中T对应U，所述泡状结构处于环状双链DNA模板中互补部分的两端，泡状结构的长度为5
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15bp，泡状结构的两条链之间连续互补的碱基不超过2个；步骤二，将制备的环状双链DNA模板纯化，去除环状双链DNA模板中混杂着的线性单链DNA；步骤三，将纯化的环状双链DNA模板、RNA聚合酶、核糖核酸酶H、NTPs、RNA酶抑制剂、无机焦磷酸酶和相应的RNA聚合酶缓冲液混合，进行转录，所述RNA聚合酶为T7 RNA聚合酶、SP6 RNA聚合酶或者T3 RNA聚合酶，在转录过程中RNA聚合酶进行双向滚环转录，核糖核酸酶H则在环状双链DNA模板中泡状结构处DNA的辅助下对含有重复序列的转录产物进行酶切，获得目的双链RNA。2.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述泡状结构的长度为5
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15bp。3.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为70
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1000bp。4.根据权利要求1所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述双链RNA的长度为96
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278bp。5.根据权利要求1
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4任一项所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，当所述环状双链DNA模板长度小于90bp时，采用一段法，设计一条成环前体线性DNA链制备环状单链DNA，环状单链DNA和线性单链DNA退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；当所述环状双链DNA模板长度大于90bp时，采用一锅法或分步法制备环状单链DNA，然后将环状单链DNA和其互补链所对应的多条短DNA链混合，退火杂交后加入DNA连接酶和对应的连接酶缓冲液进行连接反应；所述环状单链DNA和线性单链DNA杂交后，线性单链DNA的两端距离泡状结构的边缘大于15nt。6.根据权利要求5所述的制备双链RNA的方法，其特征在于，所述退火杂交条件为：先在90℃下保温1
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3min，然后以0.1℃/s的速度降温至20
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25℃并保温10min。7...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁兴国，陈辉，安然，
申请(专利权)人：中国海洋大学，
类型：发明
国别省市：