一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法技术

本发明专利技术公开了一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法。该方法基于固定化蛋白的角度，以固定化蛋白进而提高蛋白的耐受性和重复利用性；其次通过三价钴离子与组氨酸标签的结合实现对蛋白的固定化，进而提高目标蛋白的活性。该方法的过程简单，价格低廉，用于含组氨酸标签的蛋白的固定化的操作简单，时间较短，且相比于二价钴离子与组氨酸标签的结合，三价钴离子的稳定性更好，具有很好的应用前景。景。景。

【技术实现步骤摘要】
一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法


[0001]本专利技术涉及微生物固定化领域，具体涉及一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法。

技术介绍

[0002]蛋白质固定化是指利用物理、化学或生物方法将蛋白质固定在材料表面，并使其保持活性的过程，由于蛋白质分子固有的不稳定性、易变性，使蛋白质的固定化显得尤其重要。
[0003]蛋白质的固定化主要分为定向固定和非定向固定两大类。传统的固定化方式主要为非定向，如物理吸附法，包埋法或利用蛋白质天然的基团如氨基、羧基与材料表面基团反应实现固定化。蛋白的非定向固定使蛋白的活性部位得不到充分暴露，从而降低蛋白的活性。
[0004]蛋白质的定向固定主要有：抗原/抗体的特异性亲和作用；通过分子生物学手段改造蛋白质从而进行固定化；通过材料表面与蛋白质之间相互反应的基团实现蛋白质在材料表面的定向固定。这些传统方法具有蛋白质需要纯化，需要外源催化剂，需要引入功能基团等。
[0005]L
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赖氨酸脱羧酶（CadA）可以将L
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赖氨酸直接转化为1，5
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戊二胺，1，5戊二胺是一种重要的平台化学品，可用于生产聚酰胺，但L
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赖氨酸脱羧酶的不可回收性和pH耐受性较差影响了其应用。

技术实现思路

[0006]前期研究中，如CN202110340236.X公开了一种利用二价金属离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白的方法及其应用。该方法基于固定化蛋白的角度，以固定化蛋白进而提高蛋白的耐受性和重复利用性。其次本专利技术通过二价金属离子与组氨酸标签的结合实现对蛋白的纯化和固定化，进而提高目标蛋白的活性。但是在实际应用中蛋白质的pH耐受性较差、不可收性、以及二价钴离子与L
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赖氨酸脱羧酶上的组氨酸标签结合形成的固定化材料的不稳定性，本专利技术提供了一种利用三价钴离子提高固定化蛋白活性的方法，通过三价钴离子与L
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赖氨酸脱羧酶上的组氨酸标签结合对其进行固定化，减少了对蛋白的纯化过程以及外源添加物的引入，使操作变得简单且成本低廉，提高了蛋白质的活性，pH耐受性。
[0007]为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案为：一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法，包括以下步骤：步骤1，收集培养得到的表达含组氨酸标签的蛋白的菌株，用pH5
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9的缓冲液A重悬至10
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30 OD后，超声破碎仪破碎，离心去除杂质，得到粗酶液；步骤2，将粗酶液置于缓冲液B中配置成浓度为0.5
‑
2.0g/l的粗酶液，搅拌均匀，加入20
‑
80mmol/l的二价钴离子溶液，继续搅拌，洗涤后，得到二价金属钴离子和组氨酸标签蛋白的沉淀物A，取部分沉淀物A冻干得到蛋白粉A；
步骤3，取步骤2中未冻干的二价金属钴离子和组氨酸标签蛋白的沉淀物溶于缓冲液B中，加入过氧化氢溶液，搅拌，洗涤后，冻干得到所需固定化的蛋白粉B，即三价钴离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白。
[0008]作为改进的是，步骤1中缓冲液A的pH为7.0
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7.2，缓冲液A为Tris
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盐酸缓冲液。
[0009]作为改进的是，步骤1中所述含组氨酸标签的蛋白的菌株为含组氨酸标签的L
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赖氨酸脱羧酶。
[0010]作为改进的是，步骤1中超声破碎仪的功率为300W，破碎过程为间歇式破碎。
[0011]作为改进的是，步骤2中缓冲液B为Tris
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盐酸缓冲液，粗酶液的终浓度为1g/l，二价钴离子溶液浓度为40mM，搅拌时间为30min。
[0012]作为改进的是，步骤3中过氧化氢溶液浓度为5mM，搅拌时间为30min。
[0013]有益效果：与现有技术相比，本专利技术一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法，可以适用于多种含有组氨酸标签的蛋白质，通过利用金属离子与组氨酸标签的结合实现对含组氨酸标签蛋白高速，快捷的分离纯化，通过金属离子实现对蛋白的固定化，该方法时间短，成本低，操作简单，且对蛋白的活性、耐受性都有提高；并且该方法解决了二价钴离子与组氨酸标签蛋白结合的不稳定性，使三价钴离子与组氨酸标签蛋白结合形成的固定化材料可以在有机溶剂（N,N
‑
二甲基甲酰胺，乙酸乙酯，正己醇，正十四烷）和变性剂（蛋白酶，盐酸胍，尿素，十二烷基硫酸钠）中稳定存在。
附图说明
[0014]图1为实施例1和实施例2中不同酶对L
‑
赖氨酸的消耗量。
[0015]图2为柠檬酸钠处理后对实施例2中不同固定化材料的稳定性影响。
[0016]图3为不同变性剂下对实施例1和实施例2中不同蛋白的影响。
[0017]图4为不同pH对活性的影响。
[0018]图5为不同温度对活性的影响。
[0019]图6为不同催化时间对活性的影响。
[0020]图7为不同赖氨酸浓度对活性的影响。
[0021]图8为不同有机溶剂下对实施例1和实施例2中不同蛋白的影响。
具体实施方式
[0022]下面结合附图对本专利技术的技术方法做进一步的详细说明。
[0023]需要说明的是，以下实施例中所用到的材料均为市售可购买的，且操作中未具体撰写的步骤如培养菌株的方法、催化、以及活性测定等等都为本领域常规手段，无需特殊说明。
[0024]实施例1L
‑
赖氨酸脱羧酶消耗L
‑
赖氨酸收集培养得到表达大肠杆菌来源L
‑
赖氨酸脱羧酶的BL21（DE3）/pCDF
‑
duet
‑
CadA菌株（已在专利CN201810195975.2中发表公开），用pH5
‑
9的缓冲液重悬至20 OD后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度。反应体系为1ml，将蛋白粉溶于pH7的Tris
‑
Hcl缓冲液中，L
‑
赖氨酸脱羧酶的终浓度为0.2g/l，加入终浓度为0.1mM
的PLP，放于37℃的水浴锅中预热2
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3min，加入终浓度为100g/l的L
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赖氨酸盐酸盐溶液，放入37℃的摇床中反应5min，然后煮沸5min停止反应。
[0025]实施例2固定化L
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赖氨酸脱羧酶消耗L
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赖氨酸2.1Co
2+
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CadA的制备收集培养得到表达大肠杆菌来源L
‑
赖氨酸脱羧酶的BL21（DE3）/pCDF
‑
duet
‑
CadA菌株（已在专利CN201810195975.2中发表公开），用pH5
‑
9的缓冲液重悬后，超声破碎仪破碎；离心去除杂质，得到粗酶液，并用酶标仪测定蛋白浓度。
[0026]反应本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，收集培养得到的表达含组氨酸标签的蛋白的菌株，用pH5
‑
9的缓冲液A重悬至10
‑
30 OD后，超声破碎仪破碎，离心去除杂质，得到粗酶液；步骤2，将粗酶液置于缓冲液B中配置成浓度为0.5
‑
2.0g/l的粗酶液，搅拌均匀，加入20
‑
80mmol/l的二价钴离子溶液，继续搅拌，洗涤后，得到二价金属钴离子和组氨酸标签蛋白的沉淀物A，取部分沉淀物A冻干得到蛋白粉A；步骤3，取步骤2中未冻干的二价金属钴离子和组氨酸标签蛋白的沉淀物溶于缓冲液B中，加入过氧化氢溶液，搅拌，洗涤后，冻干得到所需固定化的蛋白粉B，即三价钴离子与组氨酸标签纯化并固定化蛋白。2.根据权利要求1所述的一种利用三价钴离子提高固定化蛋白稳定性的方法，其特征在于，步骤1...

【专利技术属性】
技术研发人员：李辉，曾金磊，陈可泉，李春秋，周彩莲，陆秋豪，欧阳平凯，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：