一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明专利技术还公开了编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因及其获取方法和应用。本发明专利技术还公开了绿盲蝽GRK基因的dsRNA及其应用。本发明专利技术合成的GRK基因的dsRNA对绿盲蝽有显著的致死效果，有效控制绿盲蝽的种群数量，为害虫防治提供了新的途径。同时，利用大肠杆菌合成dsRNA，可以在短时间大规模的合成产物，改变了试剂盒不能大量合成dsRNA的缺点。同时该发明专利技术成本低廉，适用范围广泛，操作简单，可以重复使用，不受限制。不受限制。不受限制。

【技术实现步骤摘要】
一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其合成方法和应用


[0001]本专利技术涉及农业害虫防治
，具体涉及一种绿盲蝽GRK基因、其dsRNA及其dsRNA的高效合成方法和应用。

技术介绍

[0002]绿盲蝽Apolygus lucorum(Hemiptera：Miridae)属半翅目盲蝽科，是棉花、蔬菜、果树等多种农作物上的重要害虫。近年来，由于我国农业产业结构调整等原因，绿盲蝽在多种作物上为害趋势加重，加之长期依赖化学农药防治，致使绿盲蝽的抗药性日渐增强，对我国农业造成巨大的经济损失。目前农业生产上的绿盲蝽防控面临严峻挑战，急待开拓减少化学农药使用的新型无公害防控手段。
[0003]RNA干扰(RNAi)是由外源双链RNA(Double
‑
stranded RNA，dsRNA)介导引起的目的基因mRNA沉默的现象。1998年，首次报道了注射外源dsRNA可造成秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans内源性mRNA的沉默的现象，RNAi迅速成为热点研究。由于其具有高效、特异性强等优点，被广泛应用于昆虫基因的功能研究，并显示出其在病虫害防治方面的巨大潜力。在半翅目昆虫中的研究中，可通过基于表皮蛋白基因CP19的dsRNA注射来有效的控制蚜虫。
[0004]G蛋白偶联受体(G Protein
‑
Coupled Receptors，GPCR)是一类七次跨膜的蛋白家族，在传递20
‑
羟基蜕皮酮(20E)的信号，以调控昆虫的变态发育中发挥着重要作用。G蛋白偶联受体激酶(G Protein
‑
Coupled Receptor Kinase，GRK)是一类重要的膜蛋白，可受20E磷酸化，磷酸化后的GRK与β
‑
抑制蛋白(β
‑
arrestins)结合后发生脱敏反应，导致G蛋白不能与GRK结合，从而影响昆虫的正常发育。
[0005]因此，通过获得绿盲蝽GRK基因设计dsRNA，利用RNAi技术抑制GRK基因的表达，导致其不能正常发育最终死亡，这可能是未来的新型防治绿盲蝽的方法。但目前合成dsRNA的主要手段是T7试剂盒，成本高，合成量低，不能大规模生产。

技术实现思路

[0006]专利技术目的：本专利技术所要解决的技术问题是提供了一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶。
[0007]本专利技术还要解决的技术问题是提供了编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因及其获取方法。
[0008]本专利技术还要解决的技术问题是利用大肠杆菌进行体内合成绿盲蝽GRK基因dsRNA，成本低，效率高，可以达到靶标dsRNA的大规模的合成。
[0009]本专利技术最后要解决的技术问题是提供了该dsRNA在防治绿盲蝽中的应用。
[0010]技术方案：为了解决上述问题，本专利技术的技术方案是提供一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
[0011]编码所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0012]本
技术实现思路
还包括所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因的获取方法，包括以下步骤：
[0013]1)设计并合成上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；
[0014]2)提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板；
[0015]3)利用步骤1)合成的上下游引物和步骤2)获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列。
[0016]本
技术实现思路
还包括绿盲蝽GRK基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0017]本
技术实现思路
还包括所述的dsRNA的高效合成方法，包括以下步骤：
[0018]1)PCR扩增目的基因片段：在绿盲蝽GRK基因的dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440载体的同源序列，设计并合成上游引物如SEQ ID NO.6所示和下游引物如SEQ ID NO.7所示，以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，纯化PCR产物得到目的基因片段；
[0019]2)重组菌株的构建：用同源重组酶连接步骤1)纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体得到重组载体并进行表达得到重组菌株；
[0020]3)诱导表达：将步骤2)得到的重组菌株诱导表达得到菌体；
[0021]4)dsRNA的提取和纯化：提取菌体的总RNA，加入RNase A和DNaes I去除单链RNA和基因组DNA，得到PCR产物；加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇溶液，振荡，离心取上清；加入乙醇，充分混匀，静置，离心弃上清；用乙醇洗涤，离心收集沉淀；干燥后，用无核酸酶水溶解，获得纯化后的dsRNA。
[0022]其中，所述L4440载体序列为SEQ ID NO.8所示。
[0023]其中，所述步骤3)诱导培养基为LB液体培养基，菌液和诱导培养基按1∶50～1∶100的比例接种。
[0024]其中，步骤4)所述RNaseA的终浓度为1～10μg/mL，所述DNaes I的终浓度为0.1～1μg/μL。
[0025]本专利技术绿盲蝽GRK基因的dsRNA的高效合成方法，具体包括以下步骤：
[0026]a、PCR扩增目的基因片段：利用CE Design软件，在dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440的同源序列，设计包含Nhe I酶切位点的上游引物SEQ ID NO.5和包含Pst I酶切位点的下游引物SEQ ID NO.6；以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，并通过1％琼脂糖凝胶电泳分析；利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收纯化，得到纯化后的PCR产物。
[0027]b、载体线性化：利用两个限制性内切酶进行L4440载体的双酶切，获得线性化的L4440载体；通过1％琼脂糖凝胶电泳分析，并利用DNA胶回收试剂盒进行胶回收纯化，得到纯化后的产物。
[0028]c、表达载体构建：利用同源重组酶连接纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体；将重组连接产物转入感受态细胞E.coli DH5α中，涂布于LB固体平板上，在37℃培养箱中，先正置10min后倒置过夜培养12～14h；挑取阳性单菌落进行菌液PCR检测，琼脂糖凝胶电泳分析；将含有目的基因片段的单菌落测序分析，检测重组载体序列的准确性；将鉴定正确的单菌落接种于LB液体培养基中，37℃过夜孵育24h；利用质粒DNA提取试剂盒提取L4440重组质粒，琼脂糖凝胶电泳检测；将重组质粒转化到表达型菌株E.coli HT115中，涂板，37
℃培养箱中过夜培养12
‑
14h；挑取阳性单菌落进行PCR检测，琼脂糖凝胶跑胶验证，等比例1∶1加入50％甘油保存菌种。
[0029]d、诱导表达：将含有表达载体的E.coli HT115菌液按1∶100的比例接种于LB液体培养基中，在摇床37℃，200rpm下培养；当本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。2.编码权利要求1所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。3.权利要求2所述的绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶的基因的获取方法，其特征在于，包括以下步骤：1）设计并合成上游引物SEQ ID NO.3和下游引物SEQ ID NO.4；2）提取绿盲蝽总RNA并反转录获取cDNA模板；3）利用步骤1）合成的上下游引物和步骤2）获取的cDNA模板，通过RCR反应获得绿盲蝽GRK基因序列。4.绿盲蝽GRK基因的dsRNA，其核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。5.权利要求4所述的dsRNA的高效合成方法，其特征在于，包括以下步骤：1）PCR扩增目的基因片段：在绿盲蝽GRK基因的dsRNA核苷酸序列的两端加上与L4440载体的同源序列，设计并合成上游引物如SEQ ID NO.6所示和下游引物如SEQ ID NO.7所示，以GRK基因的cDNA序列为模板，进行PCR扩增，获得PCR产物，纯化PCR产物得到目的基因片段；2）重组菌株的构建：用同源重组酶连接步骤1）纯化后的目的基因片段与线性化L4440载体得到重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭永安，肖留斌，乔恒，赵静，姜义平，张杰钰，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：