一种抗HER2/抗PD-L1双功能抗体及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种抗HER2/抗PD

【技术实现步骤摘要】
一种抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体及其应用


[0001]本专利技术属于分子免疫学
，具体涉及一种抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体及其应用。

技术介绍

[0002]HER2过表达已在多种实体瘤中检测到，包括乳腺癌(BC)、大肠癌(CRC)、胃和胃食管交界处(GEJ)癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、胆道癌(BTC)和膀胱癌。曲妥珠单抗是一种针对HER2的人源化单克隆抗体(mAb)，是针对HER2+肿瘤的有效疗法。通过使用靶向治疗剂，HER2+BC患者的治疗已得到明显改善。但是，只有50
–
80％的HER2+BC患者受益于靶向治疗剂，而20
–
50％的患者从治疗开始就无反应或在治疗后出现耐药性。近年来，免疫检查点抑制剂已成为多种癌症的主要治疗方式。靶向程序性细胞死亡
‑
1(PD
‑
1)或程序性细胞死亡配体
‑
1(PD
‑
L1)的单克隆抗体是这些药物的主要类别。几项研究表明，免疫疗法可以提高放疗、化学疗法和/或其他靶向疗法的疗效。临床前和临床数据支持将派姆单抗、曲妥珠单抗和化学疗法联合用于治疗HER2阳性癌症。在曲妥珠单抗难治性HER2阳性转移性乳腺癌患者中，该组合可引起长期的临床反应。此外，曲妥珠单抗可在临床和临床前模型中增加PD
‑
1和PD
‑
L1的表达，可提高PD1/PD
‑
L1靶向药物的疗效。
[0003]双特异性抗体(BsAb)能够同时结合两个不同的靶标或同一靶标上的两个不同的表位。当它们与两种不同的肿瘤表面抗原相互作用时，双特异性抗体可能会提供更高的结合特异性。假设双特异性抗体可能有助于避免耐药性的发展，因为在单个肿瘤细胞上靶向两种疾病调节剂可能会增加抗癌作用，从而避免耐药性的发展。Frameworkshuffling是Dall
’
Acqua等人专利技术的一种抗体人源化方法。目前，开发存在的双功能抗体形式已被证明有超过40余种，但是由于生产效率低和药代动力学性能差等问题，一直以来双特异性抗体的研发困难重重。目前，国内外尚没有一种抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体。

技术实现思路

[0004]本专利技术的技术目的是提供一种抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体、其制备方法及其应用。
[0005]一方面，本专利技术提供了一种抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体，其包括：
[0006]单克隆抗体单元，其针对HER2并且包括2个重链和2个轻链；
[0007]单链抗体单元，其针对PD
‑
L1并且包括2个单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接；
[0008]其中，所述2个单链抗体的N端或C端分别通过linker与所述单克隆抗体单元的2条重链的Fc片段的C端连接。
[0009]在一个实施方式中，所述linker为SEQ ID NO.：8(GGGGSGGGGTGGGGS)。
[0010]在一个实施方式中，在所述单链抗体中的连接肽可为1
‑
5个重复的GGGGS的序列，例如为3个重复的GGGGS的序列，如SEQ ID NO.：9(GGGGSGGGGSGGGGS)。
[0011]在一个实施方式中，所述单链抗体的重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：10的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：11的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：12的CDR3，以及所述单链抗体的轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：13的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：14的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：15的CDR3。优选地，所述单链抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4所示。
[0012]在一个实施方式中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。
[0013]在一个实施方式中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示。
[0014]另一方面，本专利技术还提供了一种编码所述抗HER2/抗PD
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L1双功能抗体的多核苷酸。
[0015]再一方面，本专利技术还提供了一种表达载体，其包含编码所述抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体的多核苷酸。
[0016]另一方面，本专利技术提供一种所述抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体的制备方法，所述方法包括以下步骤：
[0017]1)鼠源anti
‑
PD
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L1抗体的人源化改造
[0018]用人抗体基因的Germline基因作为模板采用Framework shuffling方法将鼠源anti
‑
PD
‑
L1抗体人源化并优化为scFv的形式，其中相应的VH和VL构架改组的文库都是通过重叠PCR的全体外合成生成的，然后构建scFv噬菌体文库的克隆，筛选和鉴定，最终得到在VH44和VL100位置处引入了半胱氨酸残基的抗PD
‑
L1 scFv；
[0019]2)构建、表达和纯化抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体
[0020]曲妥珠单抗轻链和重链的氨基酸序列来自IMGT/mAb
‑
DB，将步骤1)中得到PD
‑
L1 scFvs通过linker连接肽连接到曲妥珠单抗Fc片段的C末端，
[0021]在该步骤中，合成了对应的DNA序列，并将其亚克隆到pcDNA3.1载体中并在大肠杆菌中扩增，之后通过PEI将纯化的质粒转染到HEK293细胞中，然后将细胞悬浮在FreeStyleTM293表达培养基中进行培养后，收集细胞培养上清液，并通过蛋白A柱纯化抗体，纯化的IgG1用磷酸盐缓冲液透析，速冻并保存。
[0022]另一方面，本专利技术提供一种所述抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体在制备预防、诊断、治疗或辅助治疗肿瘤的药物中的应用。
[0023]在具体实施方式中，所述药物通过结合HER2、阻断HER2信号通路从而抑制肿瘤。
[0024]在具体实施方式中，所述药物通过结合PD
‑
L1、阻断PD
‑
1与PDL
‑
1结合、激活T淋巴细胞的药物、提高T淋巴细胞中IL
‑
2、IFN
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γ表达，从而抑制肿瘤。
[0025]在具体实施方式，所述肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌、结肠直肠癌、黑色素瘤、肾瘤、本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种抗HER2/抗PD
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L1双功能抗体，其包括：单克隆抗体单元，其针对HER2并且包括2个重链和2个轻链；单链抗体单元，其针对PD
‑
L1并且包括2个单链抗体，所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区通过连接肽连接；其中，所述2个单链抗体的N端或C端分别通过linker与所述单克隆抗体单元的2条重链的Fc片段的C端连接。2.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体，其中，所述linker的序列如SEQ ID NO.：8所示。3.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD
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L1双功能抗体，其中，在所述单链抗体中的连接肽为1
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5个重复的GGGGS的序列，优选地，所述连接肽的序列如SEQ ID NO.：9所示。4.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体，其中，所述单链抗体的重链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：10的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：11的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：12的CDR3，以及所述单链抗体的轻链可变区包括氨基酸序列为SEQ ID NO.：13的CDR1、氨基酸序列为SEQ ID NO.：14的CDR2、氨基酸序列为SEQ ID NO.：15的CDR3，优选地，所述单链抗体的全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：3或SEQ ID NO.：4所示。5.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体，其中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，以及所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：6所示。6.根据权利要求1所述的抗HER2/抗PD
‑
L1双功能抗体，其中，所述双功能抗体的轻链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：5所示，以及所述双功能抗体的重链全长氨基酸序列如SEQ ID NO.：7所示。7.一...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈艺丽，王春河，刘国键，刘鑫园，谭杰，陈淦均，唐磊，丁华平，吴委涛，洪一峯，
申请(专利权)人：上海迈石生物技术有限公司深圳创石生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：