魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因敲除突变株及其应用制造技术

本发明专利技术公开了魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因敲除突变株及其应用，属于基因工程领域，是将魏氏柠檬酸杆菌野生株tpiA基因从第1位到768位之间的编码基因完全敲除而获得的，所述的tpiA基因从第1位至第768位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术魏氏柠檬酸杆菌GDFMZ BF

【技术实现步骤摘要】
魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因敲除突变株及其应用


[0001]本专利技术涉及基因工程领域，具体涉及一种生物膜形成量减少的魏氏柠檬酸杆菌基因敲除突变株及其应用。

技术介绍

[0002]柠檬酸杆菌属的细菌，营化能有机营养，能利用柠檬酸盐作为唯一碳源生长，该属的细菌都是革兰氏阴性杆菌，通常周生鞭毛、兼性厌氧、并且具有呼吸和发酵两种类型的代谢方式，发酵葡萄糖产酸产气；该属的细菌常被发现于人和动物的粪便，可能是正常肠道栖居菌，也见于土壤、水、污水和食物中，但也时常作为条件性致病菌分离自临床样品。从细菌性腹泻患者的粪便中分离的病原菌检出柠檬酸杆菌，并导致患者不同程度的腹痛、四肢无力、恶心、呕吐等。与此同时，由于该种属部分细菌的全基因组测定完成以及基于基因工程手段技术的进步，从基因水平对柠檬酸杆菌进行必要的干预和改造，并通过基因敲除等方法挖掘和验证细菌菌体及其生物被膜潜在的药物靶点，已经成为一种切实可行的手段。
[0003]tpiA基因是一种编码磷酸丙糖异构酶基因，该基因编码的蛋白酶是糖酵解途径的中心酶，是一种不需要辅因子、辅基或金属离子的分解代谢酶；其主要的作用是在三羧酸循环中催化磷酸二羟丙酮转化为甘油醛
‑3‑
磷酸，缺乏磷酸丙糖异构酶会导致磷酸二羟丙酮积累，然后转化为有毒化合物甲基乙二醛，毒性物质的积累会导致ΔtpiA生长缓慢，但不会导致ΔtpiA死亡，反而增加细菌碳源代谢、呼吸和氧化磷酸化作用以及增强膜电位。同时，研究也表明tpiA基因受CsrA(碳储存调节A)正向调控，而tpiA的过表达则会增加丙酮酸的生成量；在苯甲氯铵的作用下，肠炎沙门氏菌生物被膜产生应激反应导致tpiA表达上调；在槲皮素处理后，tpiA基因表达上调。另外，tpiA基因在很多方面有应用，tpiA敲除株应用于生产1，2
‑
丙二醇；利用tpiA敲除株生长缓慢特点，在不加抗生素情况下维持质粒在大肠杆菌中的稳定表达。
[0004]在自然界中的大部分细菌往往都不是以单个的细胞(个体)存在，而是互相聚集，以生物被膜的形式生存和生长，生物被膜作为一个细菌的聚集群体，其结构构成主要包括：水、菌体、胞外多聚物(EPS)、胞外蛋白和胞外遗传物质，如eDNA和RNA等。伤口细菌生物被膜的清除长期以来是一大难题，而临床上80％的感染都和生物被膜有关，细菌因为其易于产生生物被膜导致具有耐药性，一般杀菌剂较难清除。生物被膜的产生增加了对细胞的粘附，在适宜条件下，生物被膜可以不断释放浮游物，造成新的感染，增加了清除的难度。如何减少生物被膜的形成量，一直是科研的难点和热点。伊马替尼是蛋白质酪氨酸激酶抑制剂，常用于治疗慢性粒细胞白血病和胃肠道间质瘤，研究表明该药物还可以抑制蓝氏贾第鞭毛虫的磷酸丙糖异构酶，从而抑制寄生虫生长，近年来，通过药物抑制细菌菌体代谢过程中的重要代谢酶从而抑制细菌及其生物被膜的形成，成为控制病原菌的重要策略。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是针对现有技术中魏氏柠檬酸杆菌生物被膜难以清除的问题，提供
一种减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成的方法，可以有效减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜的形成量，从而提供其生物被膜清除的新靶点，提高清除生物被膜药物的选择效率。
[0006]本专利技术的第一个目的是提供一种魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因敲除突变株，本专利技术突变株是将魏氏柠檬酸杆菌野生株tpiA基因从第1位到768位之间的编码基因完全敲除而获得的，所述的tpiA基因从第1位至第768位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0007]优选地，该突变株为魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacter werkmanii)ΔtpiA，其保藏编号为GDMCC No:61942。
[0008]本专利技术的第二个目的是提供一种减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，将魏氏柠檬酸杆菌野生株中的tpiA基因从第1位到768位之间的编码基因完全敲除，所述的tpiA基因从第1位至第768位之间的编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
[0009]在一优选例中，减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法包括以下步骤：
[0010](1)以提取得到的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，使用PCR特异引物扩增得到tpiA基因的上下游同源序列；
[0011](2)用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收；
[0012](3)将扩增得到的tpiA基因的上下游同源片段与pYG4质粒连接构建敲除载体pYG4
‑
tpiA，然后转化大肠杆菌S17
‑
1；
[0013](4)将携带有敲除载体pYG4
‑
tpiA的大肠杆菌S17
‑
1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，共孵育物用敲除鉴定引物鉴定tpiA基因一次交换重组子；
[0014](5)然后将一次交换重组子扩大培养，使用敲除鉴定引物鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因的工程菌ΔtpiA；
[0015]优选地，魏氏柠檬酸杆菌野生株为GDFMZ BF
‑
8，其保藏号为GDMCC No:61858；
[0016]优选地，所述的PCR特异引物及其序列为：
[0017]tpiA
‑
up
‑
F：aaaagtgccacctgcagatctACCAGACAAAATGCCGCG，
[0018]tpiA
‑
up
‑
R：ctcccgccttaacaacTTCATTTCTCCACGCTTGTCAG，
[0019]tpiA
‑
down
‑
F：tgaaGTTGTTAAGGCGGGAGGAGC，
[0020]tpiA
‑
down
‑
R：agtcatatgccgcggagatctTCGCTGGTCGTCATGCCG；
[0021]所述的敲除鉴定引物为：
[0022]tpiA
‑
QJ
‑
F：GCGCTATTCGCTATGTCATAGC，
[0023]tpiA
‑
QJ
‑
R：TCGCCAGTACAACTGCGCATAT；
[0024]优选地，所述的将扩增得到的tpiA基因的上下游同源片段与pYG4质粒连接，使用的是一步无缝连接法。
[0025]本专利技术的第三个目的是提供tpiA基因在调控魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量中的应用；
[0026]优选地，通过制备阻断tpiA基因表达的药物，如伊马替尼甲磺酸盐，实现魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的减少。
[0027]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0028](1)本专利技术所得到的敲除魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因的工程菌具有降低生物被膜形成能力，其生物膜形成量与野生菌株GDFMZ BF
‑
8相比减少了70％以上；
[本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生物膜形成量减少的魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacterwerkmanii)tpiA基因敲除突变株，其特征在于，是将魏氏柠檬酸杆菌的tpiA基因敲除而获得的，所述的tpiA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。2.根据权利要求1所述的突变株，其特征在于，所述的突变株为魏氏柠檬酸杆菌(Citrobacterwerkmanii)ΔtpiA，其保藏编号为GDMCC No:61942。3.一种减少魏氏柠檬酸杆菌生物被膜形成量的方法，其特征在于，将魏氏柠檬酸杆菌野生株中的tpiA基因敲除，所述的tpiA基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)以提取得到的魏氏柠檬酸杆菌野生株基因组DNA作为模板，使用PCR特异引物扩增得到tpiA基因的上下游同源序列；(2)用BglII单酶切pYG4质粒，并割胶回收；(3)将扩增得到的tpiA基因的上下游同源片段与pYG4质粒连接构建敲除载体pYG4
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tpiA，然后转化大肠杆菌S17
‑
1；(4)将携带有敲除载体pYG4
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tpiA的大肠杆菌S17
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1与魏氏柠檬酸杆菌野生菌株共孵育，共孵育物用敲除鉴定引物鉴定tpiA基因一次交换重组子；(5)然后将一次交换重组子扩大培养，使用敲除鉴定引物鉴定成功敲除魏氏柠檬酸杆菌tpiA基因的工程菌ΔtpiA。5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，魏氏柠檬酸杆菌野生株为GDFMZ BF
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8，其保藏号为GDMCC No:618...

【专利技术属性】
技术研发人员：王颖思，周刚，谢小保，彭红，施庆珊，李彩玲，李素娟，彭如群，
申请(专利权)人：广东省科学院微生物研究所广东省微生物分析检测中心，
类型：发明
国别省市：