本发明专利技术公开了一种FGFR3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒。本发明专利技术通过对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测，制备膀胱癌诊断试剂盒中。所述检测的FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。本发明专利技术通过尿脱落肿瘤细胞细胞核DNA进行FGFR3的突变检测，为膀胱癌的辅助诊断提供一种无创的且灵敏度更高的检测方法。一种无创的且灵敏度更高的检测方法。一种无创的且灵敏度更高的检测方法。
【技术实现步骤摘要】
FGFR3基因突变检测在膀胱癌诊断中的应用及试剂盒
[0001]本专利技术属于生物医学诊断
，FGFR3基因突变检测在膀胱癌中诊断的应用及试剂盒。
技术介绍
[0002]膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。膀胱恶性肿瘤细胞之间是存在异质性的，并表现出不同的生物学特性，这些特性通常是由遗传不稳定性引起的。FGFR3可导致酪氨酸激酶受体基因激活，触发几种下游激酶途径，导致细胞转化。超过65％的非肌肉浸润性膀胱癌和15％的肌肉浸润性膀胱癌携带FGFR3突变，总突变率为40
‑
50％。FGFR3是尿路上皮癌的最常见的突变基因，为膀胱癌的诊断提供了目标靶点。
[0003]膀胱镜，影像学检查(超声，CT泌尿道成像，MRI检查，静脉尿路造影检查，全身骨显像，PET
‑
CT检查)，脱落细胞学，尿液膀胱肿瘤标志物或者FISH检查是膀胱癌最常用的检测方法。然而，膀胱镜是有创检测，医从性不佳，同时容易引起出血、感染等并发症。影像学多数早期灵敏度不佳，不能作为早期肿瘤的检测。脱落细胞学需要专业的病理医生人工判断，且在低级别肿瘤中漏诊率高。尿液膀胱肿瘤标志物(NMP22)和FISH，分别存在灵敏度偏低，稳定性差和成本高等问题。
技术实现思路
[0004]本专利技术的目的是，提供一种FGFR3基因突变检测在膀胱癌中诊断的应用及试剂盒。旨在解决现有技术中膀胱癌的诊断方法灵敏度偏低，稳定性差和成本高等问题。
[0005]本专利技术为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：
[0006]本专利技术提供FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，通过对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测制备膀胱癌诊断试剂盒。
[0007]作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。
[0008]作为优选实施方案，检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。
[0009]作为优选实施方案，所述用于FGFR3点突变检测的探针5
′
端带有荧光基团，所述荧光基团可以是VIC、FAM、ROX或HEX任意一种或几种；优选的，所述用于FGFR3点突变检测的探针3
′
端带有淬灭基团，所述淬灭基团可以是MGB，也可以是BHQ1。
[0010]本专利技术还提供一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，所述试剂盒包括细胞核DNA提取试剂和FGFR3基因突变检测试剂。
[0011]作为优选实施方案，所述试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核分选装置。
[0012]作为优选实施方案，所述细胞核DNA提取试剂包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、洗涤液
I、洗涤液II、洗脱液；
[0013]所述试剂Ⅰ的组成为：1～3mol/L的异硫氰酸胍、5～10mmol/L的柠檬酸钠、0.01～0.05g/ml的聚多卡醇、3～5mmol/L的β
‑
巯基乙醇，溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为15～45％；
[0014]所述试剂Ⅱ的组成为：20～50mg/mL的蛋白酶K、10～20mmol/L的Tris
‑
Hcl、0.1～0.5mg/ml的多聚腺苷酸(PolyA)、10～20mmol/LCaCl2，溶剂为水；
[0015]所述试剂Ⅲ的组成为：10～30mg/mL的硅羟基磁珠、体积百分比为30～50％的甘油，溶剂为水；
[0016]所述洗涤液I的组成为：1～5mol/L NaCl，1～10mmol/L的Tris
‑
HCl，溶剂为水；
[0017]所述洗涤液II的组成为：5～20mmol/L的Tris
‑
HCl、溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为70～80％；
[0018]所述洗脱液的组成为：5～20mmol/L的Tris
‑
HCl，pH值8.2
‑
8.8，溶剂为水。
[0019]作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变检测试剂的组成为：检测FGFR3基因突变位点R248C、S249C、Y375C的引物探针，热启动DNA聚合酶，热敏UDG酶，牛血清白蛋白，dATP，dCTP，dGTP，dUTP，MgCl2，Tris；(NH4)2SO4，溶剂为水。
[0020]作为优选实施方案，所述FGFR3基因突变检测试剂的各组分在PCR反应体系中的组成为：
[0021]引物浓度：100～900nM
[0022]探针浓度：25～500nM
[0023]热启动DNA聚合酶：1～50U
[0024]热敏的UDG酶：0.1～10U
[0025]牛血清白蛋白1～5wt％
[0026]dATP0.1～10mM
[0027]dCTP0.1～10mM
[0028]dGTP0.1～10mM
[0029]dUTP0.1～10mM
[0030]MgCl20.1～10mM
[0031]Tris10～100mM
[0032](NH4)2SO410～100mM
[0033]溶剂为水，pH7
‑
9。
[0034]作为优选实施方案，所述细胞膜裂解试剂包括体积百分比0.01％
‑
0.1％的Tween
‑
20，溶剂为水。
[0035]作为优选实施方案，所述细胞核分选装置由微流控芯片组成，包括液体的入口、出口、细胞核分选孔、细胞核收集腔和活塞；所述细胞核分选孔的直径在1
‑
10um之间。参见图1，为细胞核分选装置的示意图。
[0036]与现有技术相比，本专利技术的有益效果为：
[0037]1，本专利技术提供的一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，可通过肿瘤细胞细胞核DNA进行FGFR3的突变检测，为膀胱癌的辅助诊断提供一种新的方法。
[0038]2，相对于现有专利专利CN106967810B，本专利技术的阳性检出率更高。本专利技术试剂盒
在15例初诊患者中可以检出10例，阳性检出率为66.67％，专利CN106967810B提供试剂盒在15例初诊患者中可以检出8例，阳性检出率为53.33％。本专利技术阳性检出率高的主要原因在于：专利CN106967810B提取的是尿脱落细胞的总DNA，本专利技术提取的是尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA。
附图说明
[0039]图1为本专利技术细胞核分选装置的示意图。
[0040]图2为本专利技术实施例1中R248C引物及探针特异性检测结果。
[0041]图3为本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：对尿脱落肿瘤细胞的细胞核DNA进行FGFR3基因突变位点的检测。2.如权利要求1所述的FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述FGFR3基因突变位点为R248C、S249C、Y375C其中至少一种。3.如权利要求2所述的FGFR3基因突变检测在制备膀胱癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于：检测R248C突变位点的引物如SEQ ID NO：1～2所示、探针如SEQ ID NO：3所示；检测S249C突变位点的引物如SEQ ID NO：4～5所示、探针如SEQ ID NO：6所示；检测Y375C突变位点的引物如SEQ ID NO：7～8所示、探针如SEQ ID NO：9所示。4.一种用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括细胞核DNA提取试剂和FGFR3基因突变检测试剂。5.如权利要求4所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括细胞膜裂解试剂和细胞核分选装置。6.如权利要求4所述的用于FGFR3基因突变检测的试剂盒，其特征在于：所述细胞核DNA提取试剂包括试剂Ⅰ、试剂Ⅱ、试剂Ⅲ、洗涤液I、洗涤液II、洗脱液；所述试剂Ⅰ的组成为：1～3mol/L的异硫氰酸胍、5～10mmol/L的柠檬酸钠、0.01～0.05g/ml的聚多卡醇、3～5mmol/L的β
‑
巯基乙醇，溶剂为乙醇和水，其中乙醇的体积百分比为15～45％；所述试剂Ⅱ的组成为：20～50mg/mL的蛋白酶K、10～20mmol/L的Tris
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Hcl、0.1～0.5mg/ml的多聚腺苷酸、10～20mmol/L CaCl2，溶剂为水；所述试剂Ⅲ的组成为：10～30mg/mL的硅羟基磁珠、体积百分比为30～50％的甘油，溶剂为水；所述洗涤液I的组成为：1～5mol/LNaCl，1～10mmol/L的T...
【专利技术属性】
技术研发人员：王晓楠，钱祺，张亚楠，
申请(专利权)人：上海思路迪生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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