提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子及其应用方法技术

本发明专利技术公开了一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子及其应用方法。本方法采用单个或者多个藤壶黏性蛋白基因构建外源基因载体，利用分子生物学技术将藤壶黏性蛋白序列整合到家蚕基因组内，最终获得能够稳定遗传的复合丝性能优异的新型家蚕品种，利用新型家蚕品种生产复合丝。本发明专利技术发现了一种水生生物蛋白分子在提高蚕丝性能方面的用途，开发了新型的高性能复合丝。的高性能复合丝。

【技术实现步骤摘要】
提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子及其应用方法


[0001]本专利技术涉及了一种功能蛋白分子的构建及其应用的方法，尤其是涉及了一种利用水生生物藤壶黏性蛋白分子及其多个基因串联构成的蛋白分子，并利用这种蛋白序列制造高性能复合丝的方法。

技术介绍

[0002]传统的蚕丝纤维主要应用于纺织业，随着加工技术的改进和交叉学科的发展，目前已开发出许多功能性的丝纤维，拓展了应用领域，如应用于伤口愈合、生物传感器、能量收集等。

技术实现思路

[0003]为了解决
技术介绍
中存在的问题，本专利技术的目的在于开发藤壶黏性蛋白分子及其多个基因串联构成的蛋白分子人工设计方法、合成单倍或多聚蛋白分子结构，以及利用这种人工蛋白分子开发新型高性能复合丝的方法。
[0004]具体是专利技术设计了藤壶黏性蛋白分子及其多个基因串联构成的蛋白分子，并用分子生物学技术获得了能够生产包含单倍或多聚蛋白分子成分和蚕丝蛋白成分的、性能优异的复合丝的家蚕品种。
[0005]本专利技术大幅度提升了蚕丝经济价值，开创蚕桑生产新局面，具有极大的经济效益和广阔的应用前景。
[0006]为了达到上述目的，本专利技术采用的技术方案的步骤如下：
[0007]一、一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子：
[0008]所述的水生生物蛋白分子是指由单个藤壶黏性蛋白基因或者多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列。
[0009]所述多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列以藤壶黏性蛋白基因的蛋白序列多次重复连接而成。r/>[0010]所述多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列是以2
‑
32次重复连接而成。
[0011]所述的单个藤壶黏性蛋白基因的蛋白序列为SEQ ID NO.2，其DNA碱基序列为SEQ ID NO.1，。
[0012]二、水生生物蛋白分子的应用，在基因编辑和转基因家蚕中的应用。
[0013]具体是在用于基因编辑和转基因家蚕生产制备提高力学机械性能的复合丝的应用。
[0014]三、一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，方法是先通过基因工程方法生物合成目的基因序列，然后将采用分子生物学技术构建外源基因载体，通过显微注射将外源基因载体导入家蚕卵内并整合到家蚕基因组内，对家蚕进行多代培育，通过荧光显微镜筛选获得G1代阳性个体，G1代阳性个体分别与野生型交配或阳性个体自交得到G2代，G3代后均筛选阳性个体并采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种；利用G8代的家蚕
进行生产分泌蚕丝而作为复合丝，获得了提高力学机械性能的复合丝，所述的目的基因序列为权利要求1所述的单个藤壶黏性蛋白基因或者其多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列对应的基因碱基序列，最终获得能够稳定遗传的复合丝性能优异的新型家蚕品种。
[0015]所述的阳性个体是指显现荧光的个体。
[0016]所述的野生型是指未导入外源基因载体的家蚕卵培育成的个体。
[0017]所述的多聚蛋白分子对应的外源基因载体是采用以piggyBac为骨架的转基因载体或者应用于基因编辑的同源重组载体。
[0018]所述的外源基因载体包括外源基因表达框和荧光筛选标记基因表达框；外源基因表达框包括外源基因和表达框的启动子，外源基因为权利要求1所述的单个藤壶黏性蛋白基因或者其多个基因串联构成的蛋白序列对应的基因碱基序列，外源基因表达框的启动子采用丝素蛋白重链、丝素蛋白轻链、丝素蛋白P25或者丝胶蛋白等基因的启动子；
[0019]荧光筛选标记基因表达框包括荧光筛选标记基因和表达框的启动子，荧光筛选标记基因采用绿色荧光蛋白基因(GFP)或者红色荧光蛋白基因(DsRed)，荧光筛选标记基因表达框的启动子采用IE
‑
1、A3或者3xP3启动子。
[0020]所述的复合丝的组成包含了单个藤壶黏性蛋白或者其多个基因串联构成的蛋白分子成分和蚕丝蛋白成分。本专利技术设计构建的单倍多聚蛋白分子在复合丝中进行了表达，并增强了复合丝的力学机械性能。
[0021]海洋生物藤壶(Barnacle)是一类甲壳纲动物，藤壶黏性蛋白是一类分泌蛋白，在机体外发挥功能，因此在分类中被定义为“体外黏性蛋白”。藤壶黏性蛋白由5种不同蛋白质构成，根据其分子量大小依次分为：粘性蛋白(cp)100、cp68、cp52、cp20、cp19。这些蛋白质位于藤壶钙质基底和外部基质之间的天然粘附连接处，这五种蛋白质在水下黏附蛋白中都是独一无二的，在现有的数据库中均没有发现同源蛋白。这5种藤壶黏性蛋白之间除了主要结构相似度低，分子量不同，氨基酸组成偏好性也不同。在此基础上将藤壶黏性蛋白分为3类：疏水蛋白Mrcp100k和Mrcp52k；富含带电氨基酸的亲水性蛋白质Mrcp20k，以及富含Ser、Thr、Gly、Ala、Val和Lys残基的亲水性蛋白Mrcp19k和Mrcp68k。Mrcp100k和Mrcp52k是参与自组装和固化过程的黏性蛋白，它们的复合物形成了藤壶与外部基质的主要粘附区，是藤壶黏性蛋白的主要组成部分。
[0022]本专利技术研究发现，由藤壶黏性蛋白Mrcp100k构成的重组丝应力性能、特别是应变性能显著提高，可以开发新型复合丝，拓展蚕丝新用途。
[0023]本专利技术是创造性地将藤壶黏性蛋白分子构建获得了能够提高家蚕复合丝力学机械性能的蛋白序列。
[0024]本专利技术发现了一种单倍或多聚蛋白分子结构的构成方法及其新用途，开发了多种新型的高性能复合丝。
[0025]本专利技术具有的有益效果是：
[0026]本专利技术开发了一种人工设计、合成功能基因及其提高家蚕复合丝力学机械性能的方法，并获得了多种功能基因，利用这种基因获得了复合丝力学性能显著增强，这种专利技术能极大的改良蚕丝品质，创造很好的经济效益。
具体实施方式
[0027]下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。
[0028]本专利技术的实施例如下：
[0029]实施例1
[0030]采用藤壶黏性蛋白分子Mrcp
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100k的单倍序列按照家蚕密码子偏好性进行优化，优化后建立的藤壶黏性蛋白分子Mrcp
‑
100k基因碱基和蛋白序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2，通过基因工程的方法生物合成目的基因序列，采用家蚕丝素蛋白轻链启动子为表达框启动子，进一步与采用IE
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1启动子的红色荧光蛋白标志基因表达框一起，采用分子生物学技术构建转基因载体，通过显微注射将其导入家蚕卵内，并整合到家蚕基因组内。
[0031]通过荧光显微镜筛选G1阳性个体，阳性个体分别与野生型交配得到G2代，G3代后都采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种。采用G2代为材料经PCR实验验证外源基因已经成功导入家蚕基因组内。经荧光定量PCR检测表明家蚕品种中蜘蛛丝基因表达显著。采用Western blot方法证明家蚕复合丝中含有预期大小的藤壶黏性蛋白分子Mrcp
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子，其特征在于：所述的水生生物蛋白分子是指由单个藤壶黏性蛋白基因或者多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列。2.根据权利要求1所述的一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子，其特征在于：所述多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列以藤壶黏性蛋白基因的蛋白序列多次重复连接而成。3.根据权利要求1或者2所述的一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子，其特征在于：所述多个藤壶黏性蛋白基因串联构成的蛋白序列是以2
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32次重复连接而成。4.根据权利要求1所述的一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子，其特征在于：所述的单个藤壶黏性蛋白基因的蛋白序列为SEQ ID NO.2。5.权利要求1所述的一种提高蚕丝力学机械性能的水生生物蛋白分子的应用，其特征在于：在基因编辑和转基因家蚕中的应用。6.权利要求5所述的一种提高力学机械性能的水生生物蛋白分子的应用，其特征在于：在用于基因编辑和转基因家蚕生产制备提高力学机械性能的复合丝的应用。7.一种提高力学机械性能的复合丝生产方法，方法是先通过基因工程方法生物合成目的基因序列，然后将采用分子生物学技术构建外源基因载体，通过显微注射将外源基因载体导入家蚕卵内并整合到家蚕基因组内，对家蚕进行多代培育，通过荧光显微镜筛选获得G1代阳性个体，G1代阳性个体分别与野生型交配或阳性个体自交得到G2代，G3代后均筛选阳性个体并采用阳性个体自交留种，到G8代育成稳定遗传的品种，...

【专利技术属性】
技术研发人员：钟伯雄，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：