可同时诊断猪腹泻病三种高发病原的多重荧光定量引物和探针组合及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种用于同时检测猪流行性腹泻病毒（PEDV）、猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）及猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）的引物和探针组合，其中包括分别针对PEDV N基因、TGEV N基因及PDCoV N基因的三组引物和探针；进一步还包括针对18S rRNA序列作为检测中内标的引物和探针。进一步提供一种用于鉴别诊断由PEDV/TGEV/PDCoV引起猪流行性腹泻病原的多重荧光定量PCR试剂盒，包括上述的试剂盒包装成的反应液，各引物和对应探针组分别包装或混合包装。本发明专利技术通过引物和探针的设计、优化与筛选，使得在一个反应里能同时鉴别诊断猪腹泻的三种高发病原（PEDV、TGEV和PDCoV），针对这三种病原特异基因的扩增相互之间无干扰，特异性强、灵敏度高、重复性好，能够精准诊断导致猪群腹泻的病毒感染情况，具有较高的应用价值，产生巨大的经济效益。经济效益。

【技术实现步骤摘要】
可同时诊断猪腹泻病三种高发病原的多重荧光定量引物和探针组合及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学和兽医学领域，尤其涉及诊断腹泻病三种高发病原（PEDV 、TGEV和PDCoV）的多重荧光定量引物和探针组合。

技术介绍

[0002]猪流行性腹泻（PED）与猪传染性胃肠炎（TGE）是猪场最为常见的腹泻病，猪德尔塔冠状病毒病（PDCoV）是我国近几年才出现的腹泻病，但其临床症状与前二者十分相似。目前针对腹泻病的相关疫苗不能对猪只提供完全保护，且没有特效药物可以使用，严重降低了饲料报酬率，增加药物使用和人力成本，往往造成猪场重大经济损失。PED、TGE 及 PDCoV均为高度接触性肠道疾病，相应的病原均为有囊膜的单股正链 RNA病毒。猪流行性腹泻病毒（PEDV）与猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）同为 α
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冠状病毒属，其中 PEDV 基因组全长约为 28 kb，成皇冠状，包括四个结构蛋白（S、E、M、N）与 3 个非结构蛋白（ORF1a、ORF1b、ORF3）（Wang D, Fang L, Xiao S. Porcine epidemic diarrhea in China. Virus Res. 2016 Dec 2;226:7
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13.），各年龄段的猪均可感染该病毒，主要集中在哺乳仔猪与育肥猪，日龄越低的猪死亡率越高；TGEV 基因组全长约为 28.5 kb，与 PEDV 的病毒粒子形态十分相似，对热与光敏感，37℃ 下 4 天即可使病毒丧失毒力，阳光下 6 h 即可使病毒丧失活性，但对酸性环境耐受，在 PH 2 环境中依旧可以保持活力，该特征有利于病毒在胃肠道中的生存（Jung K, Saif LJ, Wang Q. Porcine epidemic diarrhea virus (PEDV): An update on etiology, transmission, pathogenesis, and prevention and control. Virus Res. 2020 Sep;286:198045），各年龄段的猪均可感染该病毒，主要感染仔猪。二者在病毒形态、临床症状与流行病学方面均相近，难以区分。猪德尔塔冠状病毒（PDCoV）基因组全长约 25 kb，属于 δ
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冠状病毒属成员。但直至 2016 年我国才分离得到首个病毒株—— NH 株（陈建飞, 王潇博, 焦贺勋,等. 国内首株猪德尔塔冠状病毒(Porcine deltacoronavirus)的分离鉴定[J]. 中国预防兽医学报, 2016(3):171
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174.）。PDCoV临床症状与 PED 症状相似，主要表现为母猪、仔猪的水样腹泻与仔猪死亡，但仔猪死亡率低于 PED。
[0003]临床上，PEDV、TGEV 及PDCoV均可对不同时期的猪进行感染，猪只发病后，主要表现为呕吐、下痢、水样腹泻、脱水等。其中，PEDV 与 TGEV 具有严格的季节性，主要集中在 11 月至次年 4 月间，PDCoV则于春末夏初时检出率较低。一项关于 2012 ~ 2015 年来自中国江西 356 腹泻样本的调查报告中显示， PDCoV 总感染率为 58.33%，单独感染率为 33.71%，与 PEDV 的混合感染率为 19.66%，表明 PEDV、TGEV 及 PDCoV 混感已经普遍存在（Song D, Zhou X, Peng Q, et al. Newly Emerged Porcine Deltacoronavirus Associated With Diarrhoea in Swine in China: Identification, Prevalence and Full
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Length Genome Sequence Analysis. Transbound Emerg Dis. 2015 Dec;62(6):575
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80.）。一般来说，猪只一旦发生腹泻，耐受力较高的猪可能在 3 ~ 7 日内自我痊愈，而抵抗力较差的则会发生死亡、流产，此外，还有部分猪只会成为僵猪，严重浪费猪场资源，造
成经济损失。对腹泻病死猪进行剖检，病变常常局限在胃肠道部分，仅凭肉眼很难区分具体的病原，且养殖场情况复杂，存在混感、弱毒感染可能，对临床诊断造成较大阻碍。因此，对三个病毒的鉴定必须借助实验室诊断技术。传统来说，病毒分离、免疫荧光试验、PCR技术均可以对上述病毒进行鉴定，但病毒分离与免疫荧光试验费时费力，不能适应于大规模流行病学调查与快速诊断，而荧光定量PCR技术则具有灵敏度高、特异性强等优势，是当代分子诊断技术中最常用的手段之一。
[0004]PEDV、TGEV及PDCoV病毒均属于RNA病毒，在进行PCR扩增前需将模板RNA反转录为互补cDNA，再进行扩增。早在1997年，Ishikawa等就建立了针对PEDV的RT
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PCR（reversetranscription
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PCR）法，将逆转录步骤与PCR扩增步骤在同一反应管中进行（IshikawaK,SekiguchiH,OginoT,etal.DirectandrapiddetectionofporcineepidemicdiarrheavirusbyRT
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PCR.JVirolMethods.1997Dec;69(1
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2):191
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5.）；2002年，KimO等建立了TGEV与PEDV的二联RT
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PCR方法，可对两个病毒同时进行检测（KimO,ChaeC.Comparisonofreversetranscriptionpolymerasechainreaction,immunohistochemistry,andinsituhybridizationforthedetectionofporcineepidemicdiarrheavirusinpigs.CanJVetRes.2002Apr;66(2):112
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6.）；针对PEDV、TGEV及PDCoV的三联RT
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PCR方法也在发现PDCoV病毒后得到迅速发展，但是多重RT
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PCR在实际使用中依旧存在灵敏度不够的问题，容易导致漏检的情况出现。
[0005]以TaqMan探针定量分析原理为基础的多重荧光定量RT
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PCR具有准确、定量、特异性强、灵敏度高等优点，其灵敏度是常规RT
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PCR的10~100倍，可以在一个反应管内同时对多个病原进行特异性扩增，不仅保证了诊断结果的准确性与时效性，并且大大提高了检测效率，同时降低了人力成本，性价比极高。多重荧光定量RT
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PCR虽然已广泛进入大家的视野，但是还存在两个较难解决的痛点：一是真正研发出一套稳定、高效、特异的引物探针组合，是十分困难的，在同一体系中完成多个目标基因的同时扩增，本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种可用于鉴别诊断 PEDV/TGEV/PDCoV 病毒的引物对和对应探针的组合，其特征在于，包括：(1) 针对PEDV N基因的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示，探针序列为SEQ ID NO.3所示；(2) 针对TGEV N基因的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示，探针序列为SEQ ID NO.6所示；以及(3) 针对PDCoV N基因的引物和探针，其引物对序列分别如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示，探针序列为SEQ ID NO.9所示。2.如权利要求1所述的引物对和对应探针的组合，其特征在于，对所述探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，SEQ ID NO.3的5
’
端用FAM修饰，3
’
端用BHQ1修饰；SEQ ID NO.6的5
’
端用VIC修饰，3
’
端用BHQ1修饰；SEQ ID NO.9的5
’
端用CY5修饰，3
’
端用BHQ3修饰。3.如权利要求1所述的引物对和对应探针的组合，其特征在于，还包括针对18S rRNA序列作为鉴别诊断猪腹泻病原的内标的引物和探针；优选地，其作内标的引物对序列分别如SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示，探针序列为SEQ ID NO.12所示；更优选地对探针的两端进行修饰，优选地为荧光标记修饰，更优选地，5
’
端用ROX修饰，3
’
端用BHQ2修饰。4.一种可用于鉴别诊断猪腹泻病原的多重荧光定量PCR试剂盒，其特征在于，其包括如权利要求1至3任一项所述的引物和探针的组合；其中所述猪腹泻由PEDV、TGEV和PDCoV中的一种或多种病毒引起的。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，将各引物对和对应的探针单独包装，或者所述引物对和探针进行混和包装。6.如权利要求5所述的试剂...

【专利技术属性】
技术研发人员：王永强，陈蕾，
申请(专利权)人：泰州蕾灵百奥生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：