一种靶向检测啮齿类动物非结合型胆汁酸的方法及其检测试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种基于气相色谱质谱联用(GC

【技术实现步骤摘要】
一种靶向检测啮齿类动物非结合型胆汁酸的方法及其检测试剂盒

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[0001]本专利技术属于生物化学检测领域，以啮齿类动物体内的非结合型胆汁酸为研究对象，开发了一种基于GC
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MS靶向分析啮齿类动物中非结合胆汁酸的新方法及其检测试剂盒。

技术介绍
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[0002]胆汁酸(BAs)是胆固醇的重要代谢产物。胆汁酸可分为结合型胆汁酸和非结合胆汁酸。近年来，研究发现非结合胆汁酸作为重要的信号分子参与代谢和免疫等调节，并与炎症性肠病、结直肠癌、肝癌等疾病的发生发展密切相关。非结合型BAs是法尼醇X受体(farnesoid X receptor,FXR)的内源性配体，而FXR是调节BAs合成和转运的关键负反馈调节受体，并且与免疫、能量代谢相关联。因此，在相关研究中非结合胆汁酸指标备受关注，其组成和变化是重要的分析目标。
[0003]非结合型BAs在甾体母核上带有一个戊酸侧链，并在α3、α6、α7和α12位含有1
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3个羟基，它们化学性质性质相似，单独依靠色谱仪进行分离和鉴定比较困难，需要使用色谱质谱联用技术。目前BAs的检测多采用液相色谱
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质谱联用(LC
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MS)技术。LC
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MS方法对结合型和非结合型BAs都可以分析。LC
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MS的优点在于，不需要对样品进行衍生化处理，样品前处理简单，但是其谱图可检索性差，鉴定缺乏通用可靠的数据库，需要依赖贵重的标准品。GC
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MS不能直接分析结合型BAs，但是适合分析非结合型BAs。使用GC
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MS分析，尽管需要对样品进行衍生化处理，但优势在于谱图的高重现性和可检索性，并拥有通用、可靠和极大容量的数据库，方便代谢物的鉴定分析。另外GC相比LC也具有更高的分离能力和灵敏度。检测生理条件下浓度相对较低的非结合型BAs，需要准确和灵敏的检测方法。大鼠和小鼠两种啮齿类动物是疾病研究中重要的模型动物，普遍应用于肠道和肝脏等胆汁酸相关疾病的研究，但是其胆汁酸检测目前存在一些问题，首先GC
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MS广泛使用数据库中只含有少数BAs的谱图，啮齿类动物特有的α
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MCA、β
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MCA、ω
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MCA未收录在库中，其次，没有研究报道提供GC
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MS检测啮齿类动物非结合型BAs的方法和试剂盒，这些都制约了GC
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MS方法在啮齿类动物BAs相关代谢研究中的应用。

技术实现思路
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[0004]本专利技术的目的在于通过确定啮齿类动物体内8种主要非结合胆汁酸的特征离子，建立一种适用于啮齿类动物体内非结合胆汁酸的基于GC
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MS靶向分析的检测方法。
[0005]本专利技术的另一目的在于提供所述方法的检测试剂盒。
[0006]本专利技术的第一方面，确立了啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸的特征离子及定量离子。
[0007]啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸的特征离子及定量离子如下所示：
[0008]在另一优选例中，所述啮齿类动物体内非结合胆汁酸特征离子及定量离子的确定采用GC
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MS全扫描(SCAN)模式进行检测。
[0009]本专利技术的第二方面，提供一种适用于啮齿类动物体内非结合胆汁酸的基于GC
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MS靶向分析的检测方法及其检测试剂盒。
[0010]另一优选例中，所述啮齿类动物体内非结合胆汁酸靶向分析检测方法采用GC
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MS SIM模式进行检测。
[0011]另一优选例中，所述试剂盒中包括啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标储备液(A)、内标CA
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D4(B)、吡啶(C)、N
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甲基
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N
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(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(D)、三甲基氯硅烷(E)、Buffer(F)；所述啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标(A)是将所有1mg/mL非结合胆汁酸(CA、CDCA、LCA、DCA、UDCA、α
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MCA、β
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MCA、ω
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MCA)储备溶液用80％甲醇稀释，制备成混标储备液，使每种非结合胆汁酸的浓度为100μg/mL。所述内标CA
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D4(B)是使用80％甲醇配制为1μg/mL的内标溶液；所述Buffer(F)为80％甲醇溶液。
[0012]另一优选例中，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：
[0013](1)标准溶液及生物样品的制备：
[0014]将8种非结合胆汁酸混标储备液(A)用Buffer(F)按梯度稀释成100、50、20、10、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL作为工作标准溶液备用。为制备标准曲线，取每个工作标准溶液50μL与50μL的内标CA
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D4(B)混合于EP管中，使混标终浓度为50、25、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/mL。使用氮气将样品吹干，干燥后的样品低温放置，保持环境干燥，便于后续操作。
[0015]血清：血清解冻后取300μL加入预冷的Buffer(F)600μL，涡旋震荡1min，冰水浴超声提取10min并于4℃，10000g离心10min；取700μL上清液转移到EP管中，加入50μL浓度1μg/mL内标CA
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D4(B)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0016]粪便：取40mg粪便，加入预冷的Buffer(F)400μL，珠磨机研磨20s，共3次，冰上超声10min，然后放在4℃静置20min。10000g离心10min，取300μL上清液转移到EP管中，加入50μL 1μg/mL内标CA
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D4(B)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0017]肝脏：称取冷冻组织样本到含有陶瓷珠的破碎管中，每60mg组织，加入预冷的Buffer(F)600μL。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μL上清液转移到EP管中，加入预冷的Buffer(F)600μL。珠磨机研磨20s，共3次，4℃，冰上超声10min，10000g离心10min，取450μL上清液转移到上述EP管中，共萃取两次，加入50μL浓度为1μg/mL内标CA
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D4(B)。使用氮气将样品吹干，以便后续进行衍生；平行处理三个样品。
[0018](2)衍生化：在上述干燥的样品(标准溶液及生物样品)中加入50μL吡啶溶液(C)将样品进行复溶，再加入50μL含有1％三甲基氯硅烷(E)的N
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甲基
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N
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(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(D)，震荡离心然后60℃金属浴30min以进行衍生化反应，获得TMS衍生物。取出样品在冰上静置1min，然后在4℃下，12000rpm离心本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于气相色谱
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质谱联用(GC
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MS)的靶向分析检测啮齿类动物体内非结合型胆汁酸的检测方法，其特征在于，所述方法对非结合胆汁酸的特征离子及定量离子的选择如下：2.如权利要求1所述的靶向分析检测方法，其特征在于，采用GC
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MS系统对啮齿类动物中的非结合胆汁酸进行检测；优选地，采用GC
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MS SIM模式进行检测。3.一种适用于啮齿类动物体内非结合胆汁酸GC
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MS靶向分析的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒配套使用的检测方法，采用权利要求1中所述的非结合胆汁酸的特征离子及定量离子。4.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于所述试剂盒中包括啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标储备液(A)、内标CA
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D4(B)、吡啶溶液(C)、N
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甲基
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N
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(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(D)、三甲基氯硅烷(E)、Buffer(F)；所述啮齿类动物体内8种非结合胆汁酸混标(A)是将所有1mg/mL非结合胆汁酸混标(包含CA、CDCA、LCA、DCA、UDCA、α
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MCA、β
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MCA、ω
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MCA)储备溶液用80％甲醇稀释，制备成混标储备液，使每种非结合胆汁酸的浓度为100μg/mL；所述内标CA
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D4(B)是使用80％甲醇配制为1μg/mL的内标溶液；所述Buffer(E)为80％甲醇溶液。5.如权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测方法包括如下步骤：(1)标准溶液及生物样品的制备：将8种非结合胆汁酸混标储备液(A)用Buffer(F)按梯度稀释成100、50、20、10、2、1、0.5、0.2、0.1μg/mL作为工作标准溶液备用；为制备标准曲线，取每个工作标准溶液50μL与50μL的内标CA
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D4(B)混合于EP管中，使混标终浓度为50、25、10、5、1、0.5、0.25、0.1、0.05μg/mL；使用氮气将样品吹干，干燥后的样品低温放置，保持环境干燥，便于后续操作；血清：血清解冻后取3...

【专利技术属性】
技术研发人员：王洪彬，何适，王蕊佳，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：