用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用制造技术

本发明专利技术提供用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用，通过采用亚硫酸氢盐修饰法对待测膀胱癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选膀胱癌高甲基化候选基因，针对膀胱癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现膀胱癌的早期筛查与诊断。断。断。

【技术实现步骤摘要】
用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用


[0001]本专利技术属于生物
，涉及一种组合物及其在疾病检测中的用途，具体地涉及一种用于检测膀胱癌的组合物及其相应的试剂盒和应用。

技术介绍

[0002]膀胱癌(bladdercancer，BC)是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤，是一种常见的泌尿系统肿瘤疾病，也是全身十大常见肿瘤之一，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的首位，也是引起泌尿系统肿瘤患者死亡的第二大肿瘤。膀胱癌可发生于任何年龄，多发生于50岁以上，发病率随年龄增长呈增加趋势，男性发病率为女性的3-4倍。膀胱癌根据治疗模式及疾病预后的不同可分为非肌层沼泽性膀胱癌(NMIBC)和肌层浸润性膀胱癌(MIBC)，按组织来源可分为膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞癌、膀胱腺癌等，其中膀胱尿路上皮癌占90％以上。膀胱癌最常见的临床特征为肉眼可见无痛性血尿，同时常伴有尿频、尿急、尿痛等刺激症状。膀胱癌治疗效果与临床分期密切相关，早期癌膀胱癌通常有较好的预后，尽早发现膀胱癌可增加手术保留膀胱的机会，提高总体生存率，早诊早治是提高治愈率的关键，同时膀胱癌的复发率为50％-70％，居所有实体瘤的首位，其中10-20％的复发患者会发展为浸润性膀胱癌，因此预后监控亦要引起重视，如何尽早发现膀胱肿瘤以及术后如何及时检测到膀胱肿瘤的复发具有非常重要的临床意义。
[0003]目前针对膀胱的检查方法主要有尿液检查、影像学检查、膀胱镜检查等，尿液检查中，尿常规检查可早期发现镜下血尿，尿脱落细胞检查可检测肿瘤细胞，但两者检测灵敏度低，易于漏检早期肿瘤；影像学检查包括超声检查、X线造影、CT等，其中超声检查广泛用于膀胱癌的诊断与血尿患者的筛查，CT尿路造影对于评估疾病分期有着不可替代的作用，但此类方法对较小的肿瘤不够灵敏，无法进行明确诊断；膀胱镜检查是目前诊断膀胱癌的可靠方法，活检病理结果是诊断膀胱癌的金标准，膀胱镜通过尿路进入膀胱，进行可视化观察，发现早期肿瘤并取样活检，但方法是一种有创操作，对需要长期跟踪观察的患者，会造成身体不适，且经济负担较重。因此有必要开发一种无创的可靠的新型膀胱癌标识物和检测技术，提高膀胱癌早癌检出率，改善膀胱癌治疗效果，降低膀胱癌死亡率。
[0004]表观遗传学是近年来肿瘤研究的热点领域，DNA的甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑以及非编码RNA调控等表观遗传学改变都被认为与肿瘤的发生有着密切关系，其中DNA的甲基化是最为常见的表观遗传学改变，其可调控细胞增殖、凋亡与分化，且水平与肿瘤的生物学特性密切相关。目前研究表明膀胱癌与其他多种癌症一样，是由多种致癌因素长期作用的结果，其病变过程是一个多基因变异累积的复杂过程，涉及多种癌基因和抑癌基因的异常甲基化，其中大多数异常甲基化为抑癌基因的高甲基化，高甲基化往往导致抑癌基因的转录沉默。DNA甲基化异常通常发生在癌症早期，并贯穿癌症的发生和发展过程，其甲基化状态一旦形成需要受到外界环境较长时间的持续刺激才会发生改变，因此DNA甲基化指标的检测可以作为癌症诊断、早期筛查以及预后的重要生物指标。
[0005]针对DNA甲基化检测方法大致可分为两类：全基因组甲基化分析和特异位点甲基
化检测。全基因组甲基化分析检测成本较高，常作为一种高通量的筛选发现目标基因的手段；特异位点甲基化检测方法有联合亚硫酸氢钠的限制性内切酶分析法(COBRA)、甲基化特异性PCR法(MSP)、甲基化荧光定量法(MethyLight)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法等，限制性内切酶分析法只能获得特殊酶切位点的甲基化情况，甲基化特异性PCR法基于普通PCR及电泳分析操作繁琐且易造成样品污染，甲基化敏感性高分辨率熔解曲线分析法对仪器要求较高，需要带高分辨率熔解(HRM)模块的荧光定量PCR仪，甲基化荧光定量法基于其高通量和高灵敏性，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差，在DNA甲基化的检测中应用广泛。目前基于甲基化荧光定量法检测膀胱癌DNA甲基化方法中针对单个基因的检测精准度未如理想，诊断效果有限，研究者常通过组合多个基因的联合检测来提高检测灵敏度，但多基因联合检测可能会导致特异性的降低，同时若采用单管单基因测试的方式进行检测，需要消耗较多的试剂，增加实验人员的操作，实验成本较高。
[0006]因此，市场迫切需要开发一种稳定可靠且具有高灵敏度与特异性的无创的膀胱癌检测方法。

技术实现思路

[0007]有鉴于此，本专利技术提供用于检测膀胱癌的组合物及其试剂盒和应用，采用亚硫酸氢盐修饰法对待测膀胱癌核酸样品进行亚硫酸氢盐转化，结合荧光定量PCR技术，综合分析文献研究结果、TCGA甲基化芯片数据库以及转录组测序表达谱，通过多重数据过滤分析，筛选膀胱癌高甲基化候选基因，针对膀胱癌高甲基化候选基因上的多个甲基化检测位点设计特异性的基因甲基化检测引物和探针，覆盖10个以上甲基化CpG位点，通过多重PCR扩增技术扩增经亚硫酸氢盐修饰的待测DNA样品，根据PCR扩增结果来确定待测样品中目标基因的甲基化情况，通过多种途径提高试剂盒的灵敏度与特异性，实现膀胱癌的早期筛查与诊断。
[0008]为达到上述目的，本专利技术第一方面提供膀胱癌基因甲基化检测位点，所述的基因甲基化检测位点包括ECRG4、TMEFF2、TWIST1中的一种或多种。
[0009]本专利技术第二方面提供膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或多种：
[0010]1)ECRG4甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的下游引物、如SEQ ID NO.4所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的下游引物、如SEQ ID NO.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.8所示的上游引物、如SEQ ID NO.9所示的下游引物、如SEQ ID NO.10所示的荧光探针；
[0011]2)TMEFF2甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.11所示的上游引物、如SEQ ID NO.12所示的下游引物、如SEQ ID NO.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQ ID NO.14所示的上游引物、如SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16所示的下游引物、如SEQ ID NO.17所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.18所示的上游引物、如SEQ ID NO.19所示的下游引物、如SEQ ID NO.20所示的荧光探针。
[0012]3)TWIST1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引
物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于膀胱癌基因甲基化检测位点，其特征在于，所述的基因甲基化检测位点包括ECRG4、TMEFF2、TWIST1中的一种或多种。2.用于膀胱癌基因甲基化检测的PCR引物探针组合，其特征在于，包括以下1)-3)所示的核酸序列组合中的一种或或多种：1)ECRG4甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合1、引物探针组合2、引物探针组合3中的一种或多种，其中所述引物探针组合1包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物、如SEQ ID NO.2与SEQ ID NO.3所示的下游引物、如SEQ ID NO.4所示的荧光探针，所述引物探针组合2包括如SEQ ID NO.5所示的上游引物、如SEQ ID NO.6所示的下游引物、如SEQ ID NO.7所示的荧光探针，所述引物探针组合3包括如SEQ ID NO.8所示的上游引物、如SEQ ID NO.9所示的下游引物、如SEQ ID NO.10所示的荧光探针；2)TMEFF2甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合4、引物探针组合5、引物探针组合6中的一种或多种，其中所述引物探针组合4包括如SEQ ID NO.11所示的上游引物、如SEQ ID NO.12所示的下游引物、如SEQ ID NO.13所示的荧光探针，所述引物探针组合5包括如SEQ ID NO.14所示的上游引物、如SEQ ID NO.15与SEQ ID NO.16所示的下游引物、如SEQ ID NO.17所示的荧光探针，所述引物探针组合6包括如SEQ ID NO.18所示的上游引物、如SEQ ID NO.19所示的下游引物、如SEQ ID NO.20所示的荧光探针。3)TWIST1甲基化检测的PCR引物及探针，包括引物探针组合7、引物探针组合8、引物探针组合9中的一种或多种，其中所述引物探针组合7包括如SEQ ID NO.21所示的上游引物、如SEQ ID NO.22所示的下游引物、如SEQ ID NO.23所示的荧光探针，所述引物探针组合8包括如SEQ ID NO.24所示的上游引物、如SEQ ID NO.25所示的下游引物、如SEQ ID NO.26所示的荧光探针，所述引物探针组合9包括如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：邵琦，
申请(专利权)人：安徽达健医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：