壳聚糖-聚二甲双胍在作为基因转染试剂方面的应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药技术领域，本发明专利技术公开了壳聚糖

【技术实现步骤摘要】
壳聚糖
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聚二甲双胍在作为基因转染试剂方面的应用


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)的制备方法。

技术介绍

[0002]基因药物易于降解，不易穿透细胞膜等各类屏障系统进入细胞，需借助有效的递送载体才能发挥作用。因此，开发高效的基因递送载体是当前亟待解决的研究问题。基因转染是生命科学、医药、农业领域的常用操作技术。现有的基因转染技术普遍存在转染效率低以及毒性等问题。
[0003]目前，常用的基因递送载体包括病毒载体与非病毒载体二类。病毒载体(腺相关病毒和慢病毒)可有效递送基因，但有许多局限性，如具有潜在的致癌作用、免疫原性、有限的DNA包装尺寸，生产难度大。非病毒载体表现出相对较少的副作用，在基因递送方面具有独特优势。阳离子聚合物是一类应用最为广泛的非病毒载体，在生理pH范围内具有较高的DNA包装能力。阳离子聚合物通过修饰、静电吸附等作用与核酸形成纳米复合物，提高核酸稳定性与细胞摄取效率，实现基因转染。常用的阳离子聚合物有聚乙烯亚胺(PEI)赖氨酸，聚己内酯等，存在毒性较高、合成成本高等缺点。
[0004]壳聚糖(Chitosan)是天然高分子碱性多糖，来源广泛，生物相容，无毒，无免疫原性，生物可降解，经酰基化、羧基化、羟基化、季铵化、醇化、酯化等改性修饰制备成的功能化衍生物常常具有较好的理化性质与生物学性能，能够满足生物化工领域的多种需求。二甲双胍是一种安全性高、成本低的双胍类药物，临床用于治疗2型糖尿病。目前，发现二甲双胍还是一种低毒的抗肿瘤药物，通过PP2A
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GSK3β
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MCL
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1通路促进肿瘤细胞凋亡，对乳腺癌、肺癌等多种癌症有效。也有报道指出二甲双胍的抗癌作用主要归因于其对AMPK激酶的激活作用和对mTOR的抑制作用。本专利技术基于壳聚糖与二甲双胍，提出一种基因转染试剂，解决现有基因转染试剂毒性高、合成成本高、转染效率有限的问题。

技术实现思路

[0005]专利技术目的：针对现有技术中存在的问题或不足，本专利技术提供一种壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用及壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)的制备方法。
[0006]为实现上述专利技术目的，本专利技术的实施例提供壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用，并与市售试剂进行转染效果比较。
[0007]进一步的，壳聚糖
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聚二甲双胍可使细胞周期同步至G2/M期，实现高效的细胞转染。
[0008]进一步的，具体包括以下过程：
[0009]S1、试剂的预混：CS
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PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合；CS
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PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1，涡旋3s，37℃温育30min；制备得到待转染的复合物CS
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PolyMet/pDNA；
[0010]S2、转染DNA/RNA至细胞：贴壁细胞以一定密度接种至6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入CS
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PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)，培养24h。
[0011]本专利技术的实施例还提供一种基因转染试剂，其特征在于，采用壳聚糖
‑
聚二甲双胍。
[0012]进一步的，所述基因转染试剂通过聚合物所携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。
[0013]进一步的，所述基因转染试剂还可添加医学上可接受的辅助试剂。
[0014]本专利技术的实施例另外还提供壳聚糖
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聚二甲双胍的制备方法，其特征在于，包括以下过程：称取0.5g壳聚糖(Chitosan，CS)，壳聚糖的分子量为：50
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190kDa，加20mL水，搅拌至充分溶胀，加入2M盐酸1mL，继续搅拌至壳聚糖完全溶解，放入100℃油浴中，搅拌条件下分批加入0.5g双氰胺，回流反应24h，反应完毕后纯水透析3天(MWCO：14kDa)，冷冻干燥，得白色絮状的CS
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PolyMet粉末，易溶于水，粉末可4℃保存。
[0015]进一步的，所述壳聚糖
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聚二甲双胍的合成路线如下：
[0016][0017]本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：
[0018](1)本专利技术采用壳聚糖与双氰胺为原料，两者按一定比例接枝共聚，制备壳聚糖
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聚二甲双胍；该聚合物易溶于水，带有大量正电荷，能有效负载各类核酸药物，所带胍基有利于核酸药物跨越组织屏障、透过细胞膜，促进药物递送。同时，该聚合物还保有二甲双胍的生物学活性。本专利技术制备的壳聚糖
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聚二甲双胍在转染剂量下有细胞周期同步作用，可使细胞同步至G2/M期，而细胞在G2/M期处于分裂前的准备阶段，大量合成RNA与蛋白质，细胞同步于这一时期有利于基因转染。本专利技术通过具体实施例中的相关实验研究证实了本专利技术制备的壳聚糖
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聚二甲双胍在同等转染条件下转染效果优于现有市售试剂。
[0019](2)本专利技术的转染试剂采用壳聚糖
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聚二甲双胍，通过该聚合物携带的正电荷负载基因并穿膜，通过二甲双胍的活性作用使细胞周期同步至G2/M期，一步实现高效的基因转染。因此，本专利技术弥补了现有市售转染试剂仅能通过阳离子穿膜作用实现转染、需另外添加细胞周期同步试剂来提高转染效率的缺陷与不足。
[0020](3)本专利技术的转染试剂使用天然来源的壳聚糖，生物相容性好、生物可降解，另一重要组分为低毒活性成分二甲双胍。因此，本专利技术的转染试剂毒性低，对细胞影响小，在转
染剂量或高于转染剂量3倍内对细胞没有明显的毒性，优于现有市售试剂，弥补了现有市售试剂毒性较大的缺陷与不足。
[0021](4)本专利技术的转染试剂使用壳聚糖
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聚二甲双胍，壳聚糖
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聚二甲双胍的原料来源广泛，合成成本低，合成过程操作便捷。综合壳聚糖
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聚二甲双胍低毒、高效的基因转染效果与低廉的生产成本，使其有望替代现有试剂成为新型商用基因转染试剂，具备市场化应用价值。
附图说明
[0022]图1为本专利技术的壳聚糖
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聚二甲双胍合成路线。
[0023]图2为本专利技术的实施例中聚合物的核磁共振氢谱谱图；图中，CS：壳聚糖，CS
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PolyMet：壳聚糖
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聚二甲双胍。
[0024]图3为本专利技术的实施例中本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.壳聚糖
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聚二甲双胍(CS
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PolyMet)在作为基因转染试剂方面的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，壳聚糖
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聚二甲双胍可使细胞周期同步至G2/M期，实现高效的细胞转染。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，具体包括以下过程：S1、试剂的预混：CS
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PolyMet溶液和pDNA溶液等体积混合；CS
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PolyMet与DNA/RNA的质量比为10:1，涡旋3s，37℃温育30min；制备得到待转染的复合物CS
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PolyMet/pDNA；S2、转染DNA/RNA至细胞：贴壁细胞以一定密度接种至6孔板，培养24h，换用无血清培养基，每孔分别加入CS
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PolyMet/pDNA(含2μg pDNA)，培养24h。4.一种基因转染试剂，其特征在于，采用壳聚糖
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聚二甲双胍。5.根据权利要求1所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨欢，王洲，汪洋，王国华，姜正林，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：