GGH基因在提高生育酚产量中的应用、高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母及其应用制造技术

本发明专利技术提供香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因的表达在提高重组解脂亚罗酵母菌生育酚产量中的应用。本发明专利技术还提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母及其构建方法，所述重组解脂亚罗酵母表达香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因。本发明专利技术在解脂亚罗酵母菌中构建生育酚异源合成途径，得到高产生育酚的重组解脂亚罗酵母菌，其生育酚的产量可达到423.7μg/g DCW，其中γ

【技术实现步骤摘要】
GGH基因在提高生育酚产量中的应用、高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母及其应用


[0001]本专利技术属于代谢工程和组合生物学
，具体涉及一种提高生育酚产量的重组菌及其构建方法和应用。
技术背景
[0002]生育酚(tocopherol)属于维生素E(Vitamin E)的一个类型。它是由酚类环状头部和一个具有饱和脂肪族侧链的脂肪酸尾部构成，对人类的身体健康有着非常重要的作用。根据氢醌基团上甲基的位置和数量，将生育酚分为4种：α，β，γ和δ，其中a
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生育酚更易被机体吸收，因此，α
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生育酚被认为是最具活性的物质。生育酚是重要的抗氧化剂，具有清除自由基，终止脂质链式氧化反应的作用，且对心血管疾病、癌症等有积极作用，还可以提高免疫力、抗衰老和促进生育功能。
[0003]目前天然生育酚的提取工艺有很多种，主要有化学处理法、生物提取法、通过蒸馏萃取分离提纯高浓度的生育酚。由于天然生育酚无论在生物学活性还是在安全性上均优于化学合成品，因此国内外一般采用植物油脱臭馏出物为原料来提取天然生育酚，国外提取工艺主要有酯化(酯交换)
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蒸馏法、皂化
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萃取法、水解
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蒸馏法、酯化
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超临界萃取法等，技术相对比较成熟，提取效率较高。国内生产主要采用植物油脱臭馏出物酯化法。目前这些方法主要存在收率低、纯度不高、浪费较大、易污染环境、设备昂贵、操作复杂及质量差等问题。生物技术的迅速发展为天然生育酚的生产提供了崭新的途径，通过生物工程技术手段解决产物合成关键酶基因的克隆，通过基因调控高效表达，能够有效提高植物天然生育酚含量。
[0004]目前，生育酚生物合成途径已明确，相关重要基因被成功克隆。研究者将番茄的GGR基因在番茄中超表达，发现叶片中的α
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生育酚含量提高了33.4％
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38.6％(Liu H,Liu J,Zhao M M,Chen J S.Overexpression of ShCHL P in tomato improves seedling growth and increases tolerance to salt,osmotic,and oxidative stresses[J].Plant Growth Regulation,2015,77(2):211
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221.)；另外有研究者在拟南芥中过表达大麦HGGT，使γ
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生育三烯酚大量积累，生育酚和三烯酚总量提高10
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15倍(CAHOON E B,HALL S E,RIPP K G,et al.Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants for tocotrienol production and increased antioxidant content[J].Nat Biotechnol,2003,21(9):I 082
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7.)；以及在大豆中过表达拟南芥MPBQMT和γ
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TMT，使α
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生育酚比例提高到90％
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95％(VAN EENENNAAM A L,LINCOLN K,DURRETT T P,et al.Engineering vitamin E content:from Arabidopsis mutant to soy oil[J].Plant Cell,2003,15(12):3007
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19.)等。国内沈斌的研究在酿酒酵母中构建了生育三烯酚异源合成途径，成功表达了生育三烯酚合成途径中关键基因，但是生育酚合成途径中的必需基因GGH基因无法表达，因此无法构建生育酚异源合成途径。本专利基于微生物发酵在解脂亚罗酵母中构建生育酚异源合成途径，通过基因挖掘筛选能成功表达的GGH基因，并筛选出一株生育酚产量最高的重组菌株。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题是针对现有的生产生育酚的方法存在的产量低的问题，提供一种能够产生育酚的重组菌，以及该重组菌的构建方法和应用。
[0006]本专利技术的思路是通过筛选能够在解脂亚罗酵母菌中成功表达的生育酚合成基因，在解脂亚罗酵母菌中构建生育酚异源合成途径，并通过基因挖掘筛选到高产生育酚的重组解脂亚罗酵母菌。
[0007]本专利技术提供香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因的表达在提高重组解脂亚罗酵母菌生育酚产量中的应用。
[0008]优选地，所述香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因选自来源于向日葵的HaGGH基因(其序列如SEQ ID No.1所示)、来源于花生的AhGGH基因(其序列如SEQ ID No.2所示)、来源于辣椒的CbGGH基因(其序列如SEQ ID No.3所示)和来源于油橄榄的OeGGH基因(其序列如SEQ ID No.4所示)。
[0009]本专利技术的香叶基香叶基二磷酸还原酶从来源于油菜、向日葵、花生、拟南芥、大麦、番茄、马铃薯、辣椒、三叶木瓜、菟丝子、凤梨、油橄榄、丹参和水青树中选取，经过验证确认只有来源于向日葵(HaGGH，其序列如SEQ ID No.1所示)、花生(AhGGH，其序列如SEQ ID No.2所示)、辣椒(CbGGH基因，其序列如SEQ ID No.3所示)和油橄榄(OeGGH基因，其序列如SEQ ID No.4所示)的GGH基因能够实现有效表达。
[0010]基于此，本专利技术还提供高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母表达香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因。
[0011]其中，所述香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因选自来源于向日葵的HaGGH基因、来源于花生的AhGGH基因、来源于辣椒的CbGGH基因和来源于油橄榄的OeGGH基因。
[0012]作为一种优选的实施方式，所述重组解脂亚罗酵母还表达4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)、尿黑酸植基转移酶(HPT)、2
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甲基
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植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)、生育酚环化酶(TC)和γ
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生育酚甲基转移酶(γ
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TMT)基因。其序列分别如SEQ ID NO:5，SEQ ID NO:6，SEQ ID NO:7，SEQ ID NO:8，SEQ ID NO:9所示。
[0013]在本专利技术中，所述4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)基因来源于蓝藻，尿黑酸植基转移酶(HPT)基因来源于蓝藻，2
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甲基
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植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因来源于拟南芥，生育酚环化酶(TC)基因来源于蓝藻，γ
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生育酚甲基转移酶(γ
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TMT)基因来源于拟南芥。
[0014]本专利技术还提供上述重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因的表达在提高重组解脂亚罗酵母菌生育酚产量中的应用。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因选自来源于向日葵的HaGGH基因、来源于花生的AhGGH基因、来源于辣椒的CbGGH基因和来源于油橄榄的OeGGH基因。3.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母表达香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因。4.根据权利要求3所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述香叶基香叶基二磷酸还原酶(GGH)基因选自来源于向日葵的HaGGH基因、来源于花生的AhGGH基因、来源于辣椒的CbGGH基因和来源于油橄榄的OeGGH基因。5.根据权利要求3所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母还表达4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)、尿黑酸植基转移酶(HPT)、2
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甲基
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植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)、生育酚环化酶(TC)和γ
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生育酚甲基转移酶(γ
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TMT)基因。6.根据权利要求5所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)基因来源于蓝藻，尿黑酸植基转移酶(HPT)基因来源于蓝藻，2
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甲基
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植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因来源于拟南芥，生育酚环化酶(TC)基因来源于蓝藻，γ
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生育酚甲基转移酶(γ
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TMT)基因来源于拟南芥。7.权利要求3
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5中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有生育酚生物合成途径基因的重组菌获取并合成来源于蓝藻的4
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羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)基因、来源于蓝藻的尿黑酸植基转移酶(HPT)基因、来源于拟南芥的2
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甲基
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植基苯醌甲基转移酶(MPBQMT)基因，来源于蓝藻的生育酚环化酶(TC)基因，和来源于拟南芥的γ
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生育酚甲基转移酶(γ
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TMT)基因，分别在HPPD、HPT、MPBQMT、TC和γ
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TMT序列末端连接EGFP基因，将合成的片段与载体ploxpura3loxp分别经酶切和连接，获得重组质粒ploxpura3loxp
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HPPD，ploxpura3loxp
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HPT,ploxpura3loxp
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MPBQMT，ploxpura3loxp
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TC和ploxpura3loxp
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γ_TMT，将重组质粒酶切线性化后，采用酵母转化试剂盒方法分别转入解脂亚罗酵母工程菌polf中，获得重组菌株Polf
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ploxpura3loxp
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HPPD、Polf
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ploxpura3loxp

【专利技术属性】
技术研发人员：孟永宏，苟元元，郭建琦，牛永洁，杨璐，
申请(专利权)人：陕西海斯夫生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：