米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法技术

本申请公开了一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：种子培养：将米曲霉的孢子悬液接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；发酵培养：将所述种子液接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。采用本申请的方法可以控制菌形，在氮源补料和转速控制的条件下得到了稳定的发酵体系，显著提高了发酵的有效体积，实现RML产量和酶活的提高。实现RML产量和酶活的提高。实现RML产量和酶活的提高。

【技术实现步骤摘要】
米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法


[0001]本申请涉及微生物发酵
，具体涉及一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法。

技术介绍

[0002]米黑根毛霉脂肪酶(Rhizomucor miehei lipase，RML)是一种典型的界面酶，在非水相环境中能催化酯合成、酯交换、酯水解、醇解等反应，广泛应用于食品加工、医药、洗涤剂等行业。野生型Rhizomucor miehei菌株产米黑根毛霉脂肪酶(RML)能力低下，而且酶液成分不稳定，难以满足米黑根毛霉脂肪酶(RML)的工业应用。有的研究者们借助基因工程技术在其他菌株中构建RML的异源表达系统，主要包括毕赤酵母、米曲霉等。虽然利用毕赤酵母作为宿主生产RML已经有较多报道，而且其表达酶活也较高，但是受限于食品安全的条件，难以得到广泛的工业应用。米曲霉作为GRAS菌株，能够成功外源表达RML，但是其酶活很低完全无法满足商业化生产的需求。因此，如何通过米曲霉高效生产RML成为研究人员和生产企业的关注焦点。
[0003]丝状真菌液体培养往往伴随着菌体形态的变化，显著影响发酵液流变、传质及混合特性，进而对产物合成产生巨大影响。通常来说，丝状真菌的形态可以分为分散菌丝(Dispersed mycelia)、聚集成簇(Clumps)、结球成团(Dense pellets)三种类型。对于不同的丝状真菌发酵最终产物，其最佳菌体形态会明显不同。在黑曲霉发酵生产糖化酶(Glucoamylase)过程中，菌球被认为是最优的过程形态。相比之下，对于黑曲霉生产柠檬酸来说，菌丝则认为是较为合适的过程形态。米曲霉生产RML过程是一个复杂的发酵体系，常常因为菌丝生长过于旺盛，造成发酵罐黏壁、发酵液上方结团成网等问题，一方面形成不均一发酵环境，影响发酵液传质、混合等特性，而且容易产生逃液等现象，造成发酵提前结束；另一方面极大程度减少发酵液有效体积，从而降低生产效率。
[0004]因此，亟待提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，获得适合RML生产的菌体形态，提高了米黑根毛霉脂肪酶的生产效率。

技术实现思路

[0005]本申请为了克服现有技术的不足，提供了一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶(RML)的方法，可以提高米曲霉生产米黑根毛霉脂肪酶的效率。
[0006]本申请提供一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：
[0007]种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.5％～0.8％％的接种量接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；
[0008]发酵培养：将所述种子液按照8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。
[0009]可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养的培养时间为26～30h。
[0010]可选的，在本申请的一些实施例中，所述米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，包括如下步骤：
[0011]种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.6％的接种量接种于种子培养基中，在温度为28℃、转速为150rpm的条件下培养28h，得到种子液；
[0012]发酵培养：将所述种子液按照10％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为28℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。
[0013]可选的，在本申请的一些实施例中，所述孢子悬液的孢子浓度为(1～5)
×
105个/mL。优选地，所述孢子悬液的孢子浓度为3
×
105个/mL。
[0014]可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养的时间可以为144h。
[0015]可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间变化，具体为：0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm。
[0016]可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵培养的过程中，当发酵体系的摄氧率(OUR)降低至5.0mmol/L/h时开始进行氮源的补料。
[0017]可选的，在本申请的一些实施例中，所述补料的具体方法为：将剩余的氮源平均分9次进行补料。具体地，氮源的补料可以分别在下列发酵时间进行：18h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h，例如每次补料150mL。
[0018]可选的，在本申请的一些实施例中，在所述发酵培养的过程中，在温度为28℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力维持在0.03～0.04MPa，标定DO电极(溶氧电极)满度。发酵过程中，通过尾气过程质谱仪并采用Biostar软件进行在线参数采集及分析尾气，并计算摄氧率(OUR)、二氧化碳释放率(CER)。
[0019]可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养基包括玉米糊精、玉米浆干粉、酵母粉、泡敌粉、KH2PO4、MgSO4·
7H2O和Na2HPO4·
12H2O。
[0020]可选的，在本申请的一些实施例中，所述种子培养基包括：玉米糊精20g/L、玉米浆干粉10g/L、酵母粉10g/L、泡敌粉1g/L、KH2PO
4 1.244g/L、MgSO4·
7H2O0.249g/L、Na2HPO4·
12H2O 6g/L。
[0021]可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基包括玉米糊精、氮源、泡敌粉、KH2PO4、MgSO4·
7H2O和Na2HPO4·
12H2O；所述氮源包括大豆蛋白胨、酵母粉。
[0022]可选的，在本申请的一些实施例中，所述发酵培养基(g/L)：玉米糊精50g/L、大豆蛋白胨30g/L、酵母粉4g/L、泡敌粉1g/L、KH2PO
4 1.12g/L、MgSO4·
7H2O 0.227g/L、Na2HPO4·
12H2O 5.33g/L。
[0023]本申请中，所述米曲霉为米曲霉A.oryzae NCBIO，由国家生化工程技术研究中心(上海)保藏。
[0024]本申请的有益效果在于：
[0025]本申请的方法可以获得高产量的RML，并且采样本申请的发酵方法可以控制菌形，在氮源补料和转速控制的条件下，得到了稳定的发酵体系，显著提高了发酵的有效体积，实
现了RML的产量和酶活的提高。
[0026]具体地，根据实施例可知，当孢子浓度为3
×
105个/mL时，发酵所得的RM本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：种子培养：将米曲霉的孢子悬液按照0.5％～0.8％％的接种量接种于种子培养基中，在温度为26～30℃、转速为100～200rpm的条件下培养，得到种子液；发酵培养：将所述种子液按照8～12％的接种量接种于发酵培养基中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm的条件下进行发酵，发酵结束后得到发酵液，即得到米黑根毛霉脂肪酶；其中，所述发酵培养基中的初始氮源量为全部氮源的10～15％，在后续的发酵过程中，对氮源进行补料。2.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述孢子悬液的孢子浓度为(1～5)
×
105个/mL；和/或所述发酵培养的时间为144h。3.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，在所述发酵的过程中，转速随发酵时间变化，具体为：0～12h：300rpm；12～24h：325rpm；24～36h：350rpm；36～72h：375rpm；72～96h：450rpm；96～120h：550rpm；120～144h：600rpm。4.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，在所述发酵培养的过程中，当发酵体系的摄氧率降低至5.0mmol/L/h时开始进行氮源的补料。5.根据权利要求1所述的米曲霉高效生产米黑根毛霉脂肪酶的方法，其特征在于，所述补料的具体方法为：将剩余的氮源平均分9次进行补料；和/或在所述发酵培养的过程中，在温度为26～30℃、初始转速为300rpm，通气为1vvm，使反应容器的压力...

【专利技术属性】
技术研发人员：储炬，许逗，田锡炜，王永红，杨倚铭，田桂尾，吴学智，庄英萍，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：