高产生育三烯酚的重组工程菌株、其构建方法及应用技术

本发明专利技术提供一种高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，该菌株含有重组质粒a和重组质粒b，其中，重组质粒a含有经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因，其编码的蛋白质包括对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶；重组质粒b含有经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因，其编码的蛋白质包括2

【技术实现步骤摘要】
高产生育三烯酚的重组工程菌株、其构建方法及应用


[0001]本专利技术属于基因工程
，特别涉及一种高产生育三烯酚的重组工程菌株，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产生育三烯酚中应用。

技术介绍

[0002]维生素E是生育酚和生育三烯酚的总称，它是一种两亲性分子，由莽草酸途径来源的极性芳香族头部和亲脂性类异戊二烯侧链组成。根据侧链的饱和度和芳香环上甲基数目和位置的不同，分为α、β、γ、δ
‑
生育酚和α、β、γ、δ
‑
生育三烯酚这8种化合物。
[0003]目前，维生素E制备方法主要有化学合成、生物提取和生物合成。化学合成法由于步骤太多、产率低、副反应多以及原料的制备技术和生产成本等问题直接影响着维生素E的产量和质量，不利于商业化生产。市面上的天然维生素E主要从植物油脱臭馏出物中提取，其中大豆油脱臭馏出物中α
‑
生育酚含量相对较高，且原料来源丰富，产量大，是目前各国提取天然α
‑
生育酚的最主要原料。生物合成法主要集中在对植物遗传工程的改造，以提高蔬菜和油料作物中维生素E的含量或各组分的比例。比如，在拟南芥中过表达大麦HGGT，使γ
‑
生育三烯酚大量积累，生育酚和三烯酚总量提高10
‑
15倍[CAHOON E B,HALL S E,RIPP K G,et al.Metabolic redesign of vitamin E biosynthesis in plants for tocotrienol production and increased antioxidant content(J].Nat Biotechnol,2003,21(9):I 082
‑
7.]；在大豆中过表达拟南芥MPBQMT和γ
‑
TMT，使α
‑
生育酚比例提高到90％
‑
95％等[VAN EENENNAAM A L,LINCOLN K,DURRETT T P,et al.Engineering vitamin E content:from Arabidopsis mutant to soy oil fJl.Plant Cell,2003,15(12):3007
‑
19.]。另外，德国斯图加特大学的研究人员通过引入光合生物来源的生育三烯酚合成途径基因，对大肠杆菌进行了代谢改造，获得了产15μg/g(细胞干重)δ
‑
生育三烯酚的工程菌株[ALBERMANN C,GHANEGAONKAR S,LEMUTH K,et al.Biosynthesis of the vitamin E compound delta
‑
tocotrienol in recombinant Escherichia coli cells[J].Chembiochem,2008,9(15):2524
‑
33.]，同一课题组在2013年又通过基因组整合和增强MEP途径，构建了产1425μg/g(细胞干重)生育三烯酚共同前体MGGBQ的工程菌株[GHANEGAONKAR S,CONRAD J,BEIFUSS U,et al.Towards the in vivo production of tocotrienol compounds:engineering of a plasmid
‑
free Escherichia coli strain for the heterologous synthesis of 2
‑
methyl
‑6‑
geranylgeranyl
‑
benzoquinol[J].J Biotechnol,2012,164(2):238
‑
47.]。然而，对于应用价值更高的γ
‑
生育三烯酚，α
‑
生育三烯酚或者α
‑
生育酚的异源生物合相关研究更少，仅见于国内于洪魏团队沈斌的研究中[沈斌.酿酒酵母中异源合成维生素E(生育三烯酚)的研究[D].浙江大学,2019.]，以酿酒酵母为研究平台，克隆来源于拟南芥、蓝藻、烟草等的关键途径基因并结合密码子优化，结合酿酒酵母中内源的莽草酸途径和MVA途径，构建出异源合成维生素E(生育三烯酚)的代谢途径，获得了较高的产量，达到244.2μg/g干重，其中γ
‑
生育三烯酚的产量为172.9μg/g干重，α
‑
生育三烯酚为71.3μg/g干重。
[0004]针对上述现有维生素E产量低的问题，本专利技术根据现有的维生素E(生育三烯酚)的合成途径(图1)，以解脂亚罗酵母菌为研究平台，对维生素E(生育三烯酚)合成关键基因进行挖掘并结合密码子优化，从而提高维生素E的产量。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是进一步维生素E产量，通过选择更优的生育三烯酚合成关键基因并进行优化，提供一种高产生育三烯酚的重组工程菌株。
[0006]基于此，本专利技术提供一种高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒a和重组质粒b，其中，所述重组质粒a含有经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因编码的蛋白质包括对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶；所述重组质粒b含有经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因编码的蛋白质包括2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ
‑
生育酚甲基转移酶。
[0007]在本专利技术中，优选地，所述对羟基苯基丙酮酸双加氧酶来源于荠菜、萝卜、白菜、山嵛菜和油菜。所述尿黑酸植基转移酶来源于柠檬草、八爪草、发菜、小球藻和蓝藻。所述2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ
‑
生育酚甲基转移酶来源于拟南芥。
[0008]作为一种特别优选的实施方式，来源于油菜的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的碱基序列如SEQ ID No.1所示，来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因的碱基序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]作为一种优选的实施方式，本专利技术的工程菌株通过SD
‑
LEU培养基获得去除ura3标记的重组解脂亚罗酵母。
[0010]进一步地，本专利技术还提供了上述重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0011]权利要求2
‑
4中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：
[0012](1)构建含有对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的重组工程菌株获取并合成来源于荠菜(CdHPPD)、萝卜(RsHPPD)、白菜(BrpHPPD)、山嵛菜(EsHPPD)和油菜(B本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.高产生育三烯酚的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述重组解脂亚罗酵母含有重组质粒a和重组质粒b，其中，所述重组质粒a含有经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成上游基因编码的蛋白质包括对羟基苯基丙酮酸双加氧酶和尿黑酸植基转移酶；所述重组质粒b含有经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因，所述经密码子优化的生育三烯酚合成下游基因编码的蛋白质包括2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ
‑
生育酚甲基转移酶。2.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述对羟基苯基丙酮酸双加氧酶来源于荠菜、萝卜、白菜、山嵛菜和油菜。3.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述尿黑酸植基转移酶来源于柠檬草、八爪草、发菜、小球藻和蓝藻。4.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述2
‑
甲基
‑6‑
香叶基香叶基苯醌甲基转移酶、生育酚环化酶和γ
‑
生育酚甲基转移酶来源于拟南芥。5.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于所述对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因来源于油菜，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，所述尿黑酸植基转移酶基因来源于小球藻，其碱基序列如SEQ ID No.2所示。6.根据权利要求1所述的重组解脂亚罗酵母，其特征在于通过SD
‑
ura培养基获得去除ura3标记的重组解脂亚罗酵母。7.权利要求2
‑
4中任一项权利要求所述的重组解脂亚罗酵母的构建方法，所述方法包括以下步骤：(1)构建含有对羟基苯基丙酮酸双加氧酶基因的重组工程菌株获取并合成来源于荠菜(CdHPPD)、萝卜(RsHPPD)、白菜(BrpHPPD)、山嵛菜(EsHPPD)和油菜(BrHPPD)的对羟基苯基丙酮酸双加氧酶(HPPD)基因序列，分别以NdeⅠ/SpeⅠ为酶切位点双酶切载体ploxpura3loxp和基因HPPD并连接获得重组质粒ploxpura3loxp
‑
CdHPPD、ploxpura3loxp
‑
RsHPPD、ploxpura3loxp
‑
BrpHPPD、ploxpura3loxp
‑
EsHPPD和ploxpura3loxp

【专利技术属性】
技术研发人员：孟永宏，王欢，苟元元，郭建琦，牛永洁，杨璐，
申请(专利权)人：西安海斯夫生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：