基于LC-MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法技术

本发明专利技术提供一种基于LC

【技术实现步骤摘要】
基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法


[0001]本专利技术属于茶酚胺及其代谢物检测
，具体涉及一种基于LC
‑
MSMS技术且同时适用于血液和尿液的对茶酚胺及其代谢物进行定量分析的方法。

技术介绍

[0002]儿茶酚胺(CA)是一类由肾上腺素肾上腺素能神经元合成和分泌的，含有儿茶酚和胺基的神经类激素，包括多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)，其主要代谢产物有3
‑
甲氧基酪胺(3
‑
MT)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)、甲氧基肾上腺素(MN)。临床上对于嗜铬细胞瘤、副神经节瘤、神经母细胞瘤、高血压、心肌梗塞、肾上腺髓质增生等疾病的诊断和治疗具有重要的临床意义。我国2020年出版了嗜铬细胞瘤和副神经节瘤诊断治疗专家共识，共识中明确：将血浆或尿液中的MN和NMN作为诊断嗜铬细胞瘤和副神经节瘤的首选指标，同时建议同时测定血浆或尿液的NE、E、DA、3
‑
MT等指标。对CA水平的测定方法也建议采用LC
‑
MSMS法或者高效液相色谱法。
[0003]国内外对于儿茶酚胺类物质的分析检测主要为高效液相色谱法，荧光光度法，毛细管电泳法，化学发光法，电化学分析及液质联用法。荧光，毛细管电泳、化学发光发、电化学分析等方法虽然简单，但是灵敏度，抗干扰能力，在多种化合物联检等方面表现出明显的不足。而高效液相色谱法，因化合物的性质，也只能实现DA\E\NE 3种原形的检测，无法对其中间代谢产物等指标做出准确的测定。
[0004]对LC
‑
MSMS法，市面上已有很多测试方法：目前杭州佰辰医学检验所有限公司于2016年申请的专利技术”一种利用液相色谱串联质谱检测血浆种儿茶酚胺的方法“中，使用丹磺酰氯进行衍生提取后进行检测，该方法样本处理复杂，不利于推广，特异性较差，且仅能检测出3种化合物。北京和合医学诊断技术股份有限公司于2019年申请的专利技术“检测24H尿液中儿茶酚胺代谢物含量的液质分析方法”仅对3种儿茶酚胺代谢物进行了检测。同样杭州凯莱谱精准医疗检测技术有限公司于2018年申请的专利技术“人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法”也只对于5种儿茶酚胺类化合物。总体来说，利用液质联用技术检测血浆或尿液种儿茶酚胺类物质过程中主要存在衍生化前处理复杂，灵敏度达不到，只能检测部分化合物等问题。也有不衍生方法进行测试，但是6种化合物出峰都集中在1min的出峰位置处，分离度差。

技术实现思路

[0005]基于现有技术中存在上述问题，本专利技术提供一种基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，其同时适用于血浆及尿液的，具有提高样本前处理效率和节约成本的优点。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术采用的技术方案如下：
[0007]一种基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，先对待测样本进行液相色谱串联质谱检测的前处理，前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，准
确定量分析茶酚胺及其代谢物；所述的标准品样本在配制过程中使用1x磷酸盐缓冲盐溶液作为替代基质。
[0008]根据以上方案，所述的茶酚胺是多巴胺(DA)、去甲肾上腺素(NE)和肾上腺素(E)；所述的代谢产物是3
‑
甲氧基酪胺(3
‑
MT)、甲氧基去甲肾上腺素(NMN)和甲氧基肾上腺素(MN)。
[0009]根据以上方案，所述的一种基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法包括以下详细步骤：
[0010]步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；
[0011]步骤S2，向待测样本加入内标工作液，然后再加入乙酸铵缓冲液，震荡混合，再离心取上清液；
[0012]步骤S3，向SPE固相萃取柱中加入甲醇进行活化，再加入乙酸铵平衡SPE固相萃取柱；
[0013]步骤S4，将步骤S2中获得的上清液加入到经过步骤S3处理后的SPE固相萃取柱中，正压压干后依次向SPE固相萃取柱中加入水、甲醇、异丙醇进行淋洗，最后用乙腈溶液洗脱，收集洗脱液后用氮气吹干洗脱液，最后用100μL纯水复溶。
[0014]步骤S5，取步骤S4中最后获得的复溶液进行液相色谱
‑
串联质谱分析。
[0015]根据以上方案，所述的液相色谱的条件如下：
[0016]分析柱：ACE EXCEL 1.7C18
‑
PFP 100
×
2.1mm；
[0017]洗脱梯度：
[0018]时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.009821.009822.5090103.505954.505955.009825.50982
[0019]流动相：A相：含0.1％乙腈的水溶液；B相：含0.1％乙腈的甲醇溶液；流速：0.4mL/min。
[0020]根据以上方案，所述的质谱条件如下：
[0021]电离方式：点喷雾电离正离子模式(ESI+)；检测方式：多重反应监测(MRM)；离子源温度(TEM)：550℃；离子源气体1(GS1)：55psi；离子源气体2(GS2)：55psi；气帘气(CUR)：40psi；喷雾电压(IS)：5500V；碰撞气(CAD)：8。
[0022]根据以上方案，所述的质谱检测中化合物MRM参数如下：
[0023]化合物Q1Q3Dwell(ms)DPCE多巴胺*154.1137.210315多巴胺154.19110332多巴胺
‑
D4158.19510332肾上腺素*166.1107.1103425
肾上腺素166.1135.2103421肾上腺素
‑
D6172.1112.1103425去甲肾上腺素*152107.1103524去甲肾上腺素152135.1103517去甲肾上腺素
‑
D6158111103524甲氧基去甲肾上腺素*166.1134.2102522甲氧基去甲肾上腺素166.1121.2102523甲氧基去甲肾上腺素
‑
D3169.1137.2102522甲氧基肾上腺素*180.1165.1104223甲氧基肾上腺素180.1148.2104224甲氧基肾上腺素
‑
D3183.1151.21042243
‑
甲氧基酪胺*151911038263
‑
甲氧基酪胺151119.11038193
‑
甲氧基酪胺
‑
D4155123.1103819
[0024]*表示该化合物的定量离子对。
[0025]本专利技术的有益效果是：
[0026]1、本方法可以使用同一方法检测血浆和尿液两种不同类型样本中的儿茶酚胺，节约成本，提高效率，便于临床推广本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于LC
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MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，其特征在于，先对待测样本进行液相色谱串联质谱检测的前处理，前处理后的各样本分别进行液相色谱串联质谱检测，准确定量分析茶酚胺及其代谢物；所述的标准品样本在配制过程中使用1x磷酸盐缓冲盐溶液作为替代基质。2.根据权利要求1所述的一种基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，其特征在于，所述的茶酚胺是多巴胺、去甲肾上腺素和肾上腺素；所述的代谢产物是3
‑
甲氧基酪胺、甲氧基去甲肾上腺素和甲氧基肾上腺素。3.根据权利要求2所述的一种基于LC
‑
MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，其特征在于，其包括以下详细步骤：步骤S1，配制系列浓度的校准品溶液、质控品溶液和内标工作液；步骤S2，向待测样本加入内标工作液，然后再加入乙酸铵缓冲液，震荡混合，再离心取上清液；步骤S3，向SPE固相萃取柱中加入甲醇进行活化，再加入乙酸铵平衡SPE固相萃取柱；步骤S4，将步骤S2中获得的上清液加入到经过步骤S3处理后的SPE固相萃取柱中，正压压干后依次向SPE固相萃取柱中加入水、甲醇、异丙醇进行淋洗，最后用乙腈溶液洗脱，收集洗脱液后用氮气吹干洗脱液，最后用100μL纯水复溶。步骤S5，取步骤S4中最后获得的复溶液进行液相色谱
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串联质谱分析。4.根据权利要求3所述的一种基于LC
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MSMS技术的茶酚胺及其代谢物定量分析的方法，其特征在于，所述的液相色谱的条件如下：分析柱：ACE EXCEL 1.7C18
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PFP 100
×
2.1mm；洗脱梯度：时间(min)流动相A(％)流动相B(％)0.009821.009822.5090103.505954.505955.009825.50982流动相：A相：含0.1％...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢永明，王朝阳，王俊霞，
申请(专利权)人：上海中科新生命生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：