一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及食品安全检测免疫分析技术领域，具体涉及一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用。所述试剂盒包含有：莱克多巴胺标准品、莱克多巴胺磁性纳米探针、莱克多巴胺纳米金纳米探针、ssDNA

【技术实现步骤摘要】
一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用


[0001]本专利技术涉及食品安全检测免疫分析
，具体涉及一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒及其应用。

技术介绍

[0002]农兽药是农业生产不可或缺的重要生产资料,对保障农业及粮食生产与安全发挥着重要作用。化学农兽药在可预见的将来, 仍是农产品质量和安全保障不可或缺的手段。食品中农兽药残留及其安全性评估受到科学研究工作者和公众的广泛关注。但是如果长期不合理使用会带来环境污染，生态破坏以及危害人体健康等问题。因此建立高效快速低成本的的兽药残留检测成为重中之重。莱克多巴胺(Ractopamine)是一种人工合成的β
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肾上腺受体激动剂，在临床上作为治疗支气管哮喘，充血性心力衰竭和肌肉萎缩症的主要药物，因其具有提高生长速率和减少胴体脂肪的作用，经常被非法添加在动物饲料中。由于莱克多巴胺易在动物体内包括肝脏、肌肉等部位大量蓄积，形成兽药残留，人类过量食用含有莱克多巴胺残留的肉及肉制品就可能引发中毒症状，对公众的健康构成直接威胁。世界各国对莱克多巴胺在养殖业的使用标准不尽相同，美国、日本等莱克多巴胺作为瘦肉精被允许用于畜禽养殖，但在中国、欧盟等该类药物被全面禁止。因此，建立高效快速的莱克多巴胺检测技术，对莱克多巴胺残留的监测及快速诊断具有重要意义。
[0003]免疫分析方法的作用和地位目前已得到国内外学者的广泛认可，免疫分析方法的研究也是检测方法研究最热门的领域之一。在免疫分析方法领域中，我国在酶联免疫分析方法方面开展了较为深入的研究，包括半抗原合成、抗体制备、标记物偶联、反应体系中各种理化性质对免疫分析方法的影响及半抗原结构与其所制备得到抗体之间的构效关系等方面。近年来，我国学者在荧光免疫分析、化学发光免疫分析、生物传感器、生物条形码和纳米金免疫分析方法方面也开展了较多的研究工作。
[0004]纳米金免疫分析方法目前已成为检测痕量蛋白质、核酸等各类物质最广泛的分析方法之一，通过与免疫反应相结合建立的纳米金免疫分析方法，将免疫分析方法拓广到各个领域。然而该方法建立至今，传统纳米金免疫分析方法检测灵敏度已变得难以满足要求，为了进一步提高检测灵敏度，使其在免疫分析方法中具有更实质性的进展，近年来发展了聚合酶链式反应（PCR）、杂交链式反应（HCR）、环介导等温扩增技术（LAMP）和滚环扩增（RCA）等扩增技术。其中滚环扩增（RCA）是一种简单，高效，恒温的核酸扩增方法。目前，各类方法的检测灵敏度有待提高。
[0005]血糖仪不同于其他大型检测设备，有着操作简单无需专业人员，携带方便，检测时间短，成本低，不受地点限制等诸多优势成为理想的现场检测设备，自专利技术起就以检测血糖为最终目标，经多年发展早已对血糖有很强特异性，限制了其应用范围。由于小分子化合物通常情况下只有一个抗原结合位点，因此纳米金免疫分析方法常规采用的“三明治”结构模式基本不能适用于农兽药或生物毒素等小分子物质的检测。

技术实现思路

[0006]针对现有技术中存在的问题，本专利技术的目的在于提供一种莱克多巴胺便携式高灵敏免疫分析测定试剂盒，该试剂盒能够同便携式血糖仪联用，可以特异地定量检测食品中莱克多巴胺含量。该试剂盒通过竞争反应体系进行检测，克服了目前免疫分析方法采用的“三明治”结构模式基本不能适用于莱克多巴胺的检测的缺陷。
[0007]本专利技术还提供了一种莱克多巴胺便携式高灵敏检测分析试剂盒的应用。
[0008]为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，所述试剂盒包含有：莱克多巴胺标准品、莱克多巴胺磁性纳米探针、莱克多巴胺纳米金纳米探针、ssDNA
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转化酶结合物。
[0009]所述莱克多巴胺磁性纳米探针由磁性纳米粒子和莱克多巴胺完全抗原偶联而成；所述莱克多巴胺纳米金纳米探针由抗莱克多巴胺抗体和滚环DNA包被纳米金颗粒得到；所述滚环DNA由硫醇修饰的单链DNA引物和环状DNA模板部分互补配对而成。
[0010]所述ssDNA
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转化酶结合物由与环状DNA模板部分相同的硫醇修饰的单链ssDNA与转化酶偶联而成。
[0011]本专利技术检测的目标物莱克多巴胺（Ractopamine）分子式：C
18
H
23
NO3Cl;CAS号：97825
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25
‑
7。
[0012]本专利技术通过改变免疫分析方法的现有反应模式，建立基于小分子竞争反应模式的免疫分析方法。通过将莱克多巴胺与载体蛋白的偶联物包被于磁性纳米粒子表面制备莱克多巴胺磁性纳米探针，并于纳米金探针表面结合兽药抗体和起信号放大作用的滚环DNA用以制备莱克多巴胺纳米金探针，利用磁性纳米粒子表面的包被抗原与兽药分子竞争结合纳米金探针表面的抗体建立竞争型免疫化学反应体系。利用磁分离系统分离免疫结合的抗原抗体复合物，采用滚环扩增反应使纳米金纳米探针结合加入的ssDNA
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转化酶结合物催化蔗糖水解生成葡萄糖，并利用便携式血糖仪快速测定葡萄糖含量，实现对莱克多巴胺兽药的定量检测。
[0013]该试剂盒的使用效果具有便携、快速、灵敏、特异、稳定等优点。并且，根据本专利技术的检测系统为开放式操作，简便快速，特别适合广大的质检机构推广使用，为食品安全检测提供一种非常有价值的检测手段。
[0014]纳米金探针是滚环DNA包被纳米金颗粒和抗被检物的抗体，滚环DNA中的单链DNA引物和纳米金颗粒通过Au—S键相连，另1个环状DNA模板是为被检物放大信号。每一个纳米金颗粒上标记有很多滚环DNA，因而起到双重放大信号的作用，灵敏度较高。
[0015]在实际操作中，滚环DNA的选择为现有技术，只要特异性和灵敏度够好即可。
[0016]优选的，所述莱克多巴胺完全抗原由莱克多巴胺和载体蛋白偶联而成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白（Casein）或鸡卵白蛋白（OVA）；所述磁性纳米粒子的粒径为18~22nm；所述纳米金颗粒的粒径为13~15nm；所述抗莱克多巴胺抗体为单克隆抗体；所述转化酶为蔗糖酶来源于面包酵母。
[0017]磁性纳米粒子的粒径对莱克多巴胺完全抗原的偶联数量有着很大的影响，从而影响着最终反应的灵敏度。
[0018]优选的，如上所述的试剂盒，所述抗莱克多巴胺抗体为单克隆抗体。
[0019]单克隆抗体由于可以通过细胞株进行生产，各批次之间性质稳定，且特异性强，因而更适合试剂盒产品。
[0020]本专利技术的技术要点是通过形成莱克多巴胺磁性纳米探针
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莱克多巴胺双标纳米金纳米探针的结合，与莱克多巴胺
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莱克多巴胺双标纳米金纳米探针的结合进行竞争，并且前者的结合应该可以均一的分离。灵敏度提高的关键在于被检物的有效回收和作为每个被检物识别结合位点对应的滚环DNA的有效滚环扩增（RCA反应）放大信号以及ssDNA
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转化酶的结合实现本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含有：莱克多巴胺标准品、莱克多巴胺磁性纳米探针、莱克多巴胺纳米金纳米探针、ssDNA
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转化酶结合物。2.根据权利要求1所述的莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述莱克多巴胺磁性纳米探针由磁性纳米粒子和莱克多巴胺完全抗原偶联而成；所述莱克多巴胺纳米金纳米探针由抗莱克多巴胺抗体和滚环DNA包被纳米金颗粒得到；所述滚环DNA由硫醇修饰的单链DNA引物和环状DNA模板部分互补配对而成。所述ssDNA
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转化酶结合物由与环状DNA模板部分相同的硫醇修饰的单链ssDNA与转化酶偶联而成。3.根据权利要求2所述的莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述莱克多巴胺完全抗原由莱克多巴胺和载体蛋白偶联而成；所述载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA）、酪蛋白（Casein）或鸡卵白蛋白（OVA）；所述磁性纳米粒子的粒径为18~22nm；所述纳米金颗粒的粒径为13~15nm；所述抗莱克多巴胺抗体为单克隆抗体；所述转化酶为蔗糖酶来源于面包酵母。4.根据权利要求1
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3任一项所述的莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述的莱克多巴胺磁性纳米探针具体由以下方法制备得到：a)微球的活化：用pH=6.0，15mmol/L的2
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(N
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吗啡啉)乙磺酸缓冲液（MES）作为活化缓冲溶液，取1mL磁珠于2.0mL离心管中，加入活化缓冲溶液后，将上清液吸掉；再用活化缓冲液重新洗涤磁珠2遍，再分别加入碳二亚胺与N
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羟基琥珀酰亚胺，在漩涡振荡器上混合均匀，室温活化30min；b)微球与BSA
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半抗原偶联：用pH=7.4，0.01mol/L的磷酸盐吐温(PBST，1%Tween
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20)溶液作偶联缓冲液，用活化缓冲液重新洗涤已经活化的磁珠3遍，再用偶联缓冲液洗涤磁珠2遍；然后用偶联缓冲液重悬磁珠，再加入BSA
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半抗原，使得磁珠表面活化的羧基与BSA的氨基于37C下反应1h，将BSA
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半抗原偶联于磁珠表面，得到免疫磁珠。c)封闭：用偶联缓冲液洗涤偶联后磁珠2遍，加入含有2% BSA的偶联缓冲液封闭磁珠60min。最终得到免疫磁性探针。5.根据权利要求1
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3任一项所述的莱克多巴胺便携式免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述莱克多巴胺纳米金探针具体由以下方法制备得到：（1）取纳米金溶液调pH至8.5~9.0后向其中加入莱克多巴胺抗体，搅拌混合，静置30~40min；然后加入硫醇修饰的单链DNA引物，静置36~48h；再调整pH至7.3~7.5，加入NaCl至浓度0.08~0.12mol/L，8000~11000r...

【专利技术属性】
技术研发人员：杜鹏飞，贺锋，王维婷，柳尧波，王守经，李腾飞，马艳丽，胡鹏，
申请(专利权)人：山东省农业科学院原子能农业应用研究所山东省辐照中心，山东省农业科学院农产品研究所，
类型：发明
国别省市：