一种血液中类固醇激素的检测方法技术

本发明专利技术涉及一种血液中类固醇激素的检测方法。本发明专利技术的检测方法包括以下步骤标准曲线干血斑样本的制备包括：用全血制备红细胞；以去激素血清为空白基质，添加标准品17α

【技术实现步骤摘要】
一种血液中类固醇激素的检测方法


[0001]本专利技术涉及分析领域，特别是涉及一种血液中类固醇激素的检测方法。

技术介绍

[0002]先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia，CAH)是肾上腺皮质功能减退较常见的原因，这是一组由于类固醇激素合成代谢中某种酶缺乏导致皮质醇合成障碍为主要特征的常染色体隐形遗传代谢性疾病，活产婴儿人群的总体发生率约在1/20000～1/10000。CAH根据酶缺陷分为6型，其中最常见的是21
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羟化酶缺乏症，约占95％；其次为11
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β羟化酶缺乏症，约占3％～5％，17α
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羟化酶/17,20
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裂解酶缺乏和3β
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羟脱氢酶缺乏，分别占1％左右，其他类型极少见。
[0003]CAH主要影响皮质醇和醛固酮生成，皮质醇影响性激素的分泌，会引起女性患儿出现男性化表现。醛固酮的作用则是通过肾脏对钠的重吸收，保持水钠平衡。约有75％的CAH患儿由于醛固酮的缺乏导致患儿的失盐、生长停滞、血容量减少性休克等，激素失衡还可导致对于男性化女性的性别错误判断，出现成年女性出现多毛、不育等问题，所以CAH的及时发现和治疗十分重要。
[0004]目前，CAH筛查主要采用放射免疫法(RIA)和酶联免疫吸附试验(ELISAs)的传统方法。但传统方法筛查的假阳性率较高，特别针对早产儿、患病或处于应激的婴儿采用免疫分析测得的17
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羟孕酮(17
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OHP)实际水平会升高，并且缺乏抗体特异性。国内外指南推荐，应用LC
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MS/MS作为二级筛查进行直接生化分析类固醇能很好地解决问题。但是，目前尚没有商品化的试剂盒，各医疗实验室普遍采用自建项目进行CAH二级筛查。但筛查过程中按照常规方法进行干血斑的制备、血斑样本的前处理，发现检测结果存在不均一、不稳定，准确性差等问题，而相关筛查目前并没有规范化的操作指导。同时，人体内存在较多的类固醇激素同分异构体，其化学性质接近，色谱出峰时间往往较为接近，常规方法很难实现多种类固醇激素同分异构体很好地分离，从而难以实现精准定量。

技术实现思路

[0005]基于此，本专利技术的目的是提供一种血液中类固醇激素的检测方法，其稳定性强，重现性好，可同时高效分离多种类固醇同分异构体。
[0006]实现上述目的的技术方案包括以下：
[0007]一种血液中类固醇激素的检测方法，包括以下步骤：
[0008]标准曲线干血斑样本的制备包括：用全血制备红细胞；以去激素血清为空白基质，添加标准品17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇、11
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脱氧皮质醇，配制一系列血清标准曲线工作液；再将所述红细胞与所述血清标准曲线工作液混合，用所得混合液制备标准曲线干血斑样本；
[0009]干血斑样本的前处理包括：取干血斑样本，加入含内标萃取液进行萃取，离心，干燥后加入复溶液，震荡，离心，采用液相色谱串联质谱法进行测定；其中，所述干血斑样本为
所述标准曲线干血斑样本或待检测的干血斑样本；所述类固醇激素包括：17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇和11
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脱氧皮质醇；所述标准品17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇、11
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脱氧皮质醇溶液的溶剂为甲醇水溶液。
[0010]在其中一些实施例中，所述干血斑样本的前处理中，取干血斑样本，置于过滤板中，加入含内标萃取液，封膜，震荡，离心，获取全部内标萃取液，干燥后加入复溶液，离心，取上清采用液相色谱串联质谱法进行测定；其中，所述过滤板采用omega膜。
[0011]在其中一些实施例中，所述过滤板为96孔过滤板。
[0012]在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的流动相中：流动相A为0.05～0.2wt％甲酸的甲醇溶液，流动相B为0.05～0.2wt％甲酸的水溶液，采用梯度洗脱。
[0013]在其中一些实施例中，所述液相色谱串联质谱法的流动相中：流动相A为0.08～0.12wt％甲酸的甲醇溶液，流动相B为0.08～0.12wt％甲酸的水溶液。
[0014]在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
[0015]0～0.01min，流动相A的体积百分比为35～50％；
[0016]0.01～1.5min，流动相A的体积百分比由35～50％升高到60～80％；
[0017]1.5～2.5min，流动相A的体积百分比为60～80％；
[0018]2.5～3min，流动相A的体积百分比由60～80％升高到90～100％；
[0019]3～3.1min，流动相A的体积百分比由90～100％降低到35～50％；
[0020]3.1～3.5min，流动相A的体积百分比为35～50％。
[0021]在其中一些实施例中，所述梯度洗脱的程序包括：
[0022]0～0.01min，流动相A的体积百分比为40～45％；
[0023]0.01～1.5min，流动相A的体积百分比由40～45％升高到68～72％；
[0024]1.5～2.5min，流动相A的体积百分比为68～72％；
[0025]2.5～3min，流动相A的体积百分比由68～72％升高到98～100％；
[0026]3～3.1min，流动相A的体积百分比由98～100％降低到40～45％；
[0027]3.1～3.5min，流动相A的体积百分比为40～45％。
[0028]在其中一些实施例中，所述含内标萃取液中的溶剂为甲醇，或者为甲醇和乙腈的混合溶液。
[0029]在其中一些实施例中，所述含内标萃取液中的溶剂为甲醇和乙腈的混合溶液，其中甲醇和乙腈的体积比为1:(0.1～0.4)。
[0030]在其中一些实施例中，所述标准曲线干血斑样本的制备中，所述红细胞与所述血清标准曲线工作液混合的时间为2.5～3.5小时。
[0031]在其中一些实施例中，所述述液相色谱串联质谱法中，色谱条件包括：
[0032]色谱柱：C18反相色谱柱；
[0033]柱温：(45
±
5)℃；
[0034]进样量：(20
±
3)μL；
[0035]流速：(0.4
±
0.1)mL/min。
[0036]在其中一些实施例中，所述述液相色谱串联质谱法中，质谱条件包括：使用电喷雾离子源(ESI)，在正离子模式下，多反应监测模式(MRM)进行检测。
[0037]在其中一些实施例中，所述标准曲线干血斑样本的制备中，所述红细胞与所述血
清标准曲线工作液的体积比为(45～65)：(35～55)本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血液中类固醇激素的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：标准曲线干血斑样本的制备包括：用全血制备红细胞；以去激素血清为空白基质，添加标准品17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇、11
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脱氧皮质醇溶液，配制一系列血清标准曲线工作液；再将所述红细胞与所述血清标准曲线工作液混合，用所得混合液制备标准曲线干血斑样本；干血斑样本的前处理包括：取干血斑样本，加入含内标萃取液进行萃取，离心，干燥后加入复溶液，离心，采用液相色谱串联质谱法进行测定；其中，所述干血斑样本为所述标准曲线干血斑样本或待检测的干血斑样本；所述类固醇激素包括：17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇和11
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脱氧皮质醇；所述标准品17α
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羟孕酮、雄烯二酮、皮质醇、21
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脱氧皮质醇、11
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脱氧皮质醇溶液的溶剂为甲醇水溶液。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述含内标提取液中的溶剂为甲醇，或者为甲醇和乙腈的混合溶液。3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述含内标提取液中的溶剂为甲醇和乙腈的混合溶液，其中甲醇和乙腈的体积比为1:(0.1
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0.4)。4.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述标准曲线干血斑样本的制备中，所述红细胞与所述血清标准曲线工作液混合的时间为2.5～3.5小时。5.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述干血斑样本的前处理中，取干血斑样本，置于过滤板中，加入含内标萃取液，封膜，震荡，离心，干燥后加入复溶液，震荡，离心，采用液相...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵蓓蓓，佘旭辉，陈秀如，董衡，李卓阳，蔡舒婷，韦兰清，
申请(专利权)人：广州金域医学检验中心有限公司，
类型：发明
国别省市：