一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法技术

本发明专利技术提供了一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法，涉及基因工程技术领域，本发明专利技术提供的在头状花序中实现基因瞬时表达的方法，采用真空渗透作用瞬时转化带蕾插穗生根、开花的植物头状花序，瞬时转化5

【技术实现步骤摘要】
一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其是涉及一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法。

技术介绍

[0002]头状花序是无限花序的一种。其特点是花轴极度缩短、膨大成扁形；花轴基部的苞叶密集成总苞。这种花序类型大多存在于菊属植物中，菊属植物边缘花为雌性的舌状花，中央盘花为两性的管状花，整个花序是由数十朵甚至上百朵舌状花和管状花组合而成。其特殊的结构，使得将外源基因转入整个头状花序的难度加大。目前农杆菌介导的叶盘法转化体系尚未完善，且存在转化周期长、转化效率低、易出现嵌合体等缺点。瞬时转化是导入外源基因后在短时间内可以检测到表达产物和功能的外源基因表达方式，目前较多应用于植物的根、茎、叶中，而此类方法在花器官尤其是头状花序中的应用较少。综上，如何提供一种效率高、周期短的头状花序瞬时转化体系是本领域人员需解决的问题。
[0003]有鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0004]本专利技术的主要目的在于提供一种在头状花序中实现基因瞬时表达的方法，以至少缓解现有技术中存在的技术问题之一。
[0005]为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：
[0006]本专利技术提供了一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法，包括：
[0007]a)将带蕾插穗进行扦插，培养至插穗生根并开花；
[0008]b)将步骤a)中得到的插穗浸没于含有农杆菌的浸染液中并置于真空环境；所述农杆菌中含有目的基因；
[0009]c)释放真空环境后进行暗培养，实现头状花序中基因的瞬时表达。
[0010]进一步的，所述头状花序为菊属植物的头状花序，所述菊属植物优选为甘野菊。
[0011]进一步的，所述带蕾插穗的幼蕾直径为2～5mm，优选2.5～4mm；插穗长度为5～10cm，优选6～8cm；
[0012]优选地，所述步骤a)中得到的插穗带有处于绽放状态中的头状花序。
[0013]进一步的，所述步骤a)中培养的光照条件为光照8h黑暗16h循环，温度条件为18～23℃，培养时间为20～30天。
[0014]进一步的，所述农杆菌选自EHA105菌株，包括pCAMBIA1305.2载体；
[0015]优选地，所述pCAMBIA1305.2载体携带有报告基因。
[0016]进一步的，所述浸染液重悬后的OD600＝1.3～1.8，优选为1.4～1.6。
[0017]进一步的，所述真空环境的气压为0.06～0.15Mpa，优选为0.08～0.13Mpa；真空持续时间为3～4min，优选3.5～4min。
[0018]进一步的，所述暗培养的温度为18～23℃，优选为20℃；时间为70～75小时，优选
为72小时。
[0019]进一步的，暗培养后还包括鉴定的步骤。
[0020]进一步的，通过染色法进行鉴定；
[0021]优选地，在侵染后5～7天通过染色法进行鉴定。
[0022]与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果：
[0023]1)转化效率高：本方法转化率高达80％，显著提高了农杆菌侵染率，且转化后目的基因片段在植物头状花序的管状花和舌状花中皆可表达，从而提高了目的基因的转化效率。
[0024]2)转化周期短：与从实生苗开始培育相比，带蕾扦插生根所需时间短，且农杆菌转化后的植株5
‑
7天即可检测，大大缩短了培育、转化周期。
[0025]3)活体侵染：本方法避免了一些遗传操作致死的缺点，所用植物材料为带蕾扦插后开花的生根苗，侵染后不损伤花瓣，可继续保持生长状态，得到完整植株。
[0026]综上，本专利技术提供的在头状花序中实现基因瞬时表达的方法，结合带蕾扦插和真空处理实现农杆菌渗入头状花序中，并且可以实现高效率的头状花序中外源基因瞬时表达，克服了头状花序难以转化成功的难题，为植物开花基因功能研究奠定了方法学基础。
附图说明
[0027]为了更清楚地说明本专利技术具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本专利技术的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0028]图1为本专利技术实施例提供的GUS染色鉴定瞬时转化甘野菊的头状花序，其中A：侵染后的头状花序；B：侵染后的舌状花；C：侵染后的管状花；D、E、F分别为A、B、C的阴性对照。
具体实施方式
[0029]除非本文另有定义，连同本专利技术使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本申请中，除非另有说明，“或”的使用意味着“和/或”。此外，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
[0030]一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本专利技术的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
[0031]下面将结合实施例对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范
围。
[0032]根据本专利技术的一个方面，提供了一种在头状花序中实现基因瞬时表达的方法，包括如下步骤：
[0033]a)将带蕾插穗进行扦插，培养至插穗生根并开花；
[0034]b)将步骤a)中得到的插穗浸没于含有农杆菌的浸染液中并置于真空环境；所述农杆菌中含有目的基因；
[0035]c)释放真空环境后进行暗培养，实现头状花序中基因的瞬时表达。
[0036]头状花序组织结构复杂且幼嫩，本专利技术提供的在头状花序中实现基因瞬时表达的方法，结合带蕾扦插和真空处理实现农杆菌渗入头状花序中，相比于已报道的常规侵染条件易导致细胞破裂死亡或无法全部侵染的问题，本专利技术可以实现高效率的头状花序中外源基因瞬时表达，转化率高达80％，且转化后目的基因片段在菊属植物头状花序的管状花和舌状花中皆可表达，克服了头状花序难以转化成功的难题，同时，农杆菌转化后的植株5
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7天即可检测，大大缩短了培育、转化周期，为植物开花基因功能研究奠定了方法学基础。
[0037]在一些优选的实施方式中，所述头状花序为菊属植物的头状花序，所述菊属植本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种在头状花序中实现基因瞬时转染的方法，其特征在于，包括：a)将带蕾插穗进行扦插，培养至插穗生根并开花；b)将步骤a)中得到的插穗浸没于含有农杆菌的浸染液中并置于真空环境；所述农杆菌中含有目的基因；c)释放真空环境后进行暗培养，实现头状花序中基因的瞬时表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述头状花序为菊属植物的头状花序，所述菊属植物优选为甘野菊。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述带蕾插穗的幼蕾直径为2～5mm，优选2.5～4mm；插穗长度为5～10cm，优选6～8cm；优选地，所述步骤a)中得到的插穗带有处于绽放状态中的头状花序。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤a)中培养的光照条件为光照8h黑暗16h循环，温度条件为18～23℃，培养时间为20～30天。5.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋爱萍，张佳丽，余琪，孙道金，管志勇，房伟民，陈素梅，陈发棣，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：