本发明专利技术涉及微生物检测技术领域，具体涉及用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用。本发明专利技术提供的针对肺炎支原体的特异性引物探针组、试剂盒的灵敏度及特异性均较好，能够特异性地检测肺炎支原体，检测限可达100copies/mL，对于低浓度样本的检测灵敏度明显更高，且具有操作简单、检测时间短的优势，具有较好的应用前景。具有较好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用
[0001]本专利技术涉及微生物检测
，具体涉及用于肺炎支原体检测的核酸片段、引物探针组、试剂盒及其应用。
技术介绍
[0002]肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae，MP)是大小介于细菌和病毒之间的一种病原微生物，主要通过飞沫以气溶胶微粒的形式传播，于1962年首次分离和培养。MP感染不仅引起肺部疾病，还能侵犯心、脑、肝、肾等其他器官，已成为小儿肺炎的重要病原体。在社区获得性肺炎(CAP)中MP是重要病原，尤其在5岁以上儿童中，MP在非流行年占CAP病原的10～20％。此外，因MP生长缓慢、潜伏期及带菌时间长，极易形成间歇期发病、长时期传播的流行特点。由于MP感染常无特异性临床表现，很容易与一般的病毒性感冒相混淆，因此MP感染需要及时确诊，做到早发现早治疗，减少儿童急性肺炎病情恶化，这其中早期诊断极为重要。
[0003]目前，肺炎支原体的检测方法主要分为以下3种：
[0004]1、病原体分离培养法：用咽拭子、痰液、胸腔积液、肺泡灌洗液等进行体外肺炎支原体分离培养，是诊断MP感染最可靠的方法，是微生物检测的“金标准”。但是MP分离培养需3至4周，且灵敏度低，耗时长，费力，技术要求高，不能满足快速诊断的需求，从而限制了其临床应用。
[0005]2、血清学检测：血清学检测方法较多，分为以下几种：
[0006](1)ELISA：ELISA法可用于检测患者急性期和恢复期血清中特异性IgM、IgG抗体，该方法特异性高、快速经济，是目前诊断支原体感染的可靠方法之一，但灵敏度低，容易出现假阴性。
[0007](2)补体结合试验：补体结合抗体在MP感染后7至9小时开始上升，3至4周达高峰。该方法灵敏度和特异性都较高，缺点为主要检测IgM抗体，易受机体免疫系统的影响而出现假阴性，多用于早期诊断。
[0008](3)间接血凝试验：试验原理与补体结合试验相似，但灵敏度高于补体结合试验。在肺炎支原体感染后7小时即可呈现阳性，10至30小时达到高峰。缺点为特异性较差。
[0009](4)冷凝集试验：人体感染MP后，血清中除了出现特异性抗体外还存在冷凝素，患者的稀释血清与O型红细胞在4℃条件下可发生凝集，此为IgM抗体，抗体效价越高或双份血清呈4倍以上升高，提示受检者近期MP感染的可能性越大，但该检测无特异性。冷凝集试验是诊断MP感染的传统方法，其灵敏度和特异性均不理想。
[0010]3、分子生物学检测：PCR是目前直接病原体检测的首选方法，这些技术包括实时PCR、巢式PCR、多重PCR、熔解曲线等。此外，还有等温扩增技术，包括SAT、LAMP等。PCR方法具有快速、灵敏、特异性强等特点，大大地提高了检测效率。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏、更特异、更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。但是目前，针对
MP鉴定的基因片段的选择和引物探针的设计存在特异性较低，与解脲脲原体、衣原体等存在交叉；部分检测试剂盒的灵敏度偏低，易造成部分样本漏检；还有些检测试剂存在无内参对照、或为外源性内参等问题；此外配套的检测体系成分复杂，不仅灵敏度低，且操作复杂，导致多数检测试剂无法实现准确、快速、灵敏的检测，这些都为肺炎支原体的检测带来了不便。
[0011]目前基于分子生物学检测肺炎支原体的方法主要有DNA和RNA检测两大类。MP死亡后其DNA仍可存在于部分患者体内，时间达7周～7个月，且不易降解，导致DNA检验结果不能很好地用于治疗效果的评估。肺炎支原体RNA在患者体内为多拷贝，其灵敏度和准确性与DNA检测方法相比都有很大提高，由于RNA随病原体死亡而降解，可作为评价MP感染转归、药物疗效的指标，其检测结果与MP的感染严重程度相关性较好，因此MP的RNA检测是目前早期快速诊断、判断疗效的最好方法之一。
[0012]目前基于RNA检测的方法采用SAT等温扩增技术，其余检测方法则基于DNA进行检测。目前市场上对于肺炎支原体的荧光定量PCR检测均为以DNA为靶标进行，在一定程度上会造成部分MP
‑
RNA含量高的样本(MP
‑
DNA含量过少)或感染早期的样本漏检，同时也不利于MP感染转归、药物疗效的判断，尤其对于感染肺炎支原体耐药菌株的患者的诊治更为不利。
技术实现思路
[0013]本专利技术的第一目的是提供用于检测肺炎支原体的核酸片段。
[0014]本专利技术的第二目的是提供用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组。
[0015]本专利技术的第三目的是提供用于检测肺炎支原体的试剂盒。
[0016]本专利技术的第四目的是提供上述核酸片段、特异性引物探针组、试剂盒的应用。
[0017]为实现上述目的，本专利技术通过对NCBI数据库中的肺炎支原体的基因组下载并通过序列多重比对，找出在不同肺炎支原体中高度保守，且与其他病原体具有明显差异的区域，经筛选和验证，最终确定以toxA基因的上述区域作为肺炎支原体检测的靶标。针对上述检测靶标设计多组特异性引物探针，经筛选和优化，最终确定了最优的引物探针组，该引物探针组针对肺炎支原体的高度保守序列，能够检测不同肺炎支原体(包括肺炎支原体I型、肺炎支原体II型等)，且具有较高的灵敏度，同时与其他病原体无交叉反应。
[0018]具体地，本专利技术提供以下技术方案：
[0019]第一方面，本专利技术提供用于检测肺炎支原体的核酸片段，其核苷酸序列如肺炎支原体基因组的第442739位至442841位所示，基因组的参考序列号为Genbank：CP039761。
[0020]以上所述的肺炎支原体基因组的参考序列号为CP039761。
[0021]以上所述的核酸片段位于toxA基因，该基因为肺炎支原体的毒素基因。
[0022]上述DNA片段为以肺炎支原体的核酸为模板、由核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示的引物扩增得到。
[0023]第二方面，本专利技术提供用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组，其包含一对特异性引物和一条探针，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0024]上述引物和探针的核苷酸序列具体如下：
[0025]SEQ ID NO 1(5
’‑3’
)：CGTGCCGACCAACACTTT；
[0026]SEQ ID NO 2(5
’‑3’
)：CCATTTCTCGATCACCAGAGTC；
[0027]SEQ ID NO 3(5
’‑3’
)：CCCGCGCCACTGGGGAGAACTTGTTAGA。
[0028]上述引物探针组中，上游引物和下游引物是针对不同基因型肺炎支原体高度保守的序列设计的，确保不会因为肺本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.用于检测肺炎支原体的核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列如肺炎支原体基因组的第442739位至442841位所示，基因组的参考序列号为Genbank：CP039761。2.根据权利要求1所述的核酸片段，其特征在于，其为以肺炎支原体的核酸为模板、由核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示的引物扩增得到。3.用于检测肺炎支原体的特异性引物探针组，其特征在于，其包含一对特异性引物和一条探针，所述特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1
‑
2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。4.根据权利要求3所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述探针含有荧光基团和淬灭基团，所述荧光基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5
’
末端，所述淬灭基团标记于SEQ ID NO.3所示序列的5
’
端第10个碱基。5.根据权利要求3或4所述的特异性引物探针组，其特征在于，所述特异性引物中含有锁核酸修饰，其中，序列如SEQ ID NO.1所示的引物的锁核酸修饰位于5
’
端第13个碱基，序列如SEQ ID NO.2所示的引物的锁核酸修饰位于5
’
端第19个碱基。6.权利要求1或2所述的核酸片段或权利要求3～5任一项所述的特异性引物探针组的如下任一种应用：(1)在制备用于检测肺炎支原体RNA的试剂盒中的应用；(2)在肺炎支原体检测中的应用。7....
【专利技术属性】
技术研发人员：李春明，朱兆奎，孔君尧，
申请(专利权)人：上海伯杰医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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