一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及应用，属于生物技术领域。该工程菌株在基因组上整合了β

【技术实现步骤摘要】
一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用


[0001]本专利技术属于生物
，尤其涉及一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株、构建及其应用。

技术介绍

[0002]甘草是一味补气类中药,是临床上应用最为广泛的中药。甘草味甘、性平，入心、脾、肺、胃经，具有补脾益气、润肺止咳、清热解毒、缓解止痛、缓和药性等作用，甘草次酸和甘草酸为甘草中的主要药用成分，其中甘草次酸是甘草酸生物合成的前体物，具有与甘草酸相似的药理生理学活性。研究表明，甘草次酸具有免疫调节、抗过敏、抗病毒感染的作用，对致癌性的病毒如肝炎病毒，EB病毒及艾滋病毒的感染均有抑制作用。由于其广泛的药用价值和经济价值，使甘草次酸的生产备受企业追捧。目前甘草次酸的合成方法主要是通过溶剂萃取法，其通过将甘草进行提取、分离、沉淀、干燥等诸多步骤得到甘草酸粉，再经提取结晶得到甘草次酸，其合成步骤多、路线长、成本高且收率低、纯度低，并不利于甘草次酸的工业生产，同时操作过程中需使用危险试剂，严重危害人体安全。也有利用酿酒酵母为宿主菌，使用合成生物学的方法生产甘草次酸，但都停留在以甘草酸为前体合成甘草次酸的阶段。
[0003]本专利技术提供了一种生物合成甘草次酸的操作方法，确切的说提供了一种以解脂耶氏酵母使用葡萄糖为底物从头生产甘草次酸的方法，该方法具有高效、快速、节能、环保、健康等诸多优势，且符合国家绿色碳环保的政策需求，是绿色可持续发展的重要路径。

技术实现思路

[0004]为了解决以上技术问题，本专利技术的目的在于提供一株以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株构建方法以及应用，该工程菌株用于以葡萄糖为底物高产甘草次酸，甘草次酸产量高、纯度高。
[0005]一种以葡萄糖为底物生物合成甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，包括以下步骤：构建得到甘草次酸生物合成表达模块质粒：β
‑
香树脂醇合成酶bAS表达模块质粒，细胞色素P450氧化酶88D6CYP88D6表达模块质粒，11位/30位
‑
氧化
‑
β
‑
香树脂醇酶CYP725A4表达模块质粒，细胞色素P450还原酶CPR表达模块质粒，将甘草次酸生物合成模块整合至解脂耶氏酵母工具质粒上，将整合了甘草次酸生物合成模块的质粒线性化后导入解脂耶氏酵母中，得到基因组上整合了甘草次酸生物合成模块的解脂耶氏酵母工程菌。
[0006]按上述方案，采用重组方式敲除解脂耶氏酵母基因组的羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)，以将代谢流导向至2，3
‑
氧化角鲨烯。
[0007]按上述方案，上述方案还包括对解脂耶氏酵母基因组进行如下重组改造：通过过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)，增强MVA代谢途
径的流向。所述截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300
‑
500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450
‑
500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列。
[0008]按上述方案，上述方案还包括在解脂耶氏酵母菌株上整合细胞色素b5。
[0009]按上述方案，所述的细胞色素b5基因序列如SEQ ID NO.9所示，来源于灰色锥虫。
[0010]按上述方案，所述的解脂耶氏酵母工具质粒为单拷贝整合质粒或多拷贝整合质粒。
[0011]按上述方案，所述的单拷贝整合质粒为pINA1269质粒；多拷贝整合质粒为pINA1292。将上述甘草次酸生物合成模块整合至多拷贝整合质粒如pINA1292质粒中，构建得到甘草次酸生物合成模块的多拷贝整合质粒，将该质粒线性化后，整入前述解脂耶氏酵母基因组中，得到在解脂耶氏酵母上基因组上整合了多个甘草次酸生物合成模块的解脂耶氏酵母工程菌。
[0012]本专利技术一种优选的实施构建方式为：
[0013]1)弱化解脂耶氏酵母菌株羊毛甾醇合酶表达，过表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)；2)强启动子调控1)所得菌株自身甲羟戊酸途径关键酶(HMGS、HMGR截断)的表达；3)增加2)所得菌株甘草次酸异源途径酶在基因组上的拷贝数；4)在3)所得菌株中过表达来源于细胞色素b5。
[0014]提供一种生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，解脂耶氏酵母工程菌基因组中整合了bAS，CYP88D6，CYP725A4，CPR基因，具有以葡萄糖为底物，经β
‑
香树脂醇，11位
‑
β
‑
香树脂醇、30位羟基
‑
11位氧化香树脂醇合成甘草次酸的能力。
[0015]按上述方案，所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上敲除羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)。
[0016]按上述方案，所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)。上述所述截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300
‑
500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450
‑
500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列。
[0017]按上述方案，所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上整合有细胞色素b5。
[0018]提供一种利用生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株在以葡萄糖为底物合成甘草次酸中的应用。
[0019]按上述方案，所述的应用方法为：
[0020]将生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株培养，获得种子液；
[0021]将种子液接种到含有葡萄糖和解脂耶氏酵母生长必需的金属元素和营养物质的发酵培养基中，分批补料发酵，发酵过程中pH控制范围为5.6
‑
6.4；分批补料葡萄糖控制其浓度在20
‑
40g/L。
[0022]按上述方案，所述的发酵温度为28
‑
32℃；发酵时间优选为120h
‑
150h。
[0023]解脂耶氏酵母可以通过摄入廉价的底物葡萄糖，经甘草次酸的高通量乙酰辅酶A至MVA，再至2.3氧化角鲨烯，通过过表达截短的trHMGR和HMGS，增强MVA的生成，同时过表达ERG1和ERG9增强了2.3氧角鲨烯的合成，进而增加了β
‑
香树脂醇合酶的前体物质，促进从β
‑
香树脂醇，经11位
‑
β
‑
香树脂醇、30位羟基
‑
11位氧化香树脂醇合成甘草次酸，由此构建得到
的解脂耶氏酵母工程菌可以廉价的葡萄糖为底物生成高附加值产物的甘草次酸产品，产量高，发酵过程简单。<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：解脂耶氏酵母工程菌基因组中整合了bAS，CYP88D6，CYP725A4，CPR基因，具有以葡萄糖为底物，从β
‑
香树脂醇，经11位
‑
β
‑
香树脂醇、30位羟基
‑
11位氧化香树脂醇合成甘草次酸的能力。2.根据权利要求1所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上敲除羊毛甾醇合酶(ERG7)位点，在该位点整合表达角鲨烯氧化酶(ERG1)和角鲨烯合酶(ERG9)。3.根据权利要求1或2所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上过表达截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)和羟甲基戊二酸合成酶(HMGS)；其中截短的羟甲基戊二酸还原酶(trHMGR)的截短范围为蛋白质N端前300
‑
500个氨基酸序列，更优选的截短范围为蛋白质N端前450
‑
500个氨基酸范围，最优选的截短序列为蛋白质N端前500个氨基酸序列。4.根据权利要求1所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的解脂耶氏酵母工程菌株的基因组上整合有细胞色素b5。5.根据权利要求4所述的生产甘草次酸的解脂耶氏酵母工程菌株，其特征在于：所述的细胞色素b5基因序列如SEQ ID NO.9所示，来源于灰色锥虫。6.权利要求1所述的解脂耶氏酵母工程菌株的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：构建得到甘草次酸生物合成表达模块质粒：β
‑
香树脂醇合成酶bAS表达模块质粒，细胞色素P450氧化酶88D6CYP88D6表达模块质粒，11位/30位
‑
氧化
‑
β
‑
香树脂醇酶CYP725A4表达模块质粒，细胞色素P450还原酶CPR表达模块质粒，将甘草次...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵云现，李迪，杨志彬，崔金旺，田昊博，胡江林，展全乐，
申请(专利权)人：河北维达康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：