反义核酸制造技术

本发明专利技术提供一种能够跳读人抗肌萎缩蛋白基因的第45号外显子的低聚物。基因的第45号外显子的低聚物。

【技术实现步骤摘要】
反义核酸
[0001]本申请是申请日为2016年9月15日、申请号为201680053726.9的中国专利技术申请“反义核酸”的分案申请。


[0002]本专利技术涉及能够跳读人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的反义低聚物及包含该低聚物的医药组合物。

技术介绍

[0003]迪谢内肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy，DMD)是约3,500人新生男孩中1人发病的频率最高的遗传性进行性肌病。虽然在婴幼儿期显示出与正常人基本上没有差别的运动能力，但从4～5岁时起可观察到肌力降低。然后肌力降低发展至12岁时变得无法行走，在20多岁时因心力衰竭或呼吸衰竭导致死亡，是严重疾病。目前，没有针对DMD的有效治疗方法，迫切需要开发新型治疗药。
[0004]已知DMD的原因是抗肌萎缩蛋白基因的变异。抗肌萎缩蛋白基因存在于X染色体，是由220万碱基的DNA形成的巨大基因。由DNA转录至mRNA前体，再通过剪接去除内含子，79个外显子接合而成的mRNA为13,993个碱基。由该mRNA翻译成3,685个氨基酸，生成抗肌萎缩蛋白。抗肌萎缩蛋白与肌细胞的膜稳定性的保持有关，为了使肌细胞不容易破坏，抗肌萎缩蛋白是必需的。DMD患者的抗肌萎缩蛋白基因存在变异，因此在肌细胞中基本上无法表达保持功能的抗肌萎缩蛋白。因此，在DMD患者体内，无法保持肌细胞的结构，大量的钙离子流入肌细胞内。其结果是发生类似炎症的反应，发生纤维化，从而使肌细胞变得难以再生。
[0005]贝克(Becker)肌营养不良症(BMD)的原因也是抗肌萎缩蛋白基因的变异，其症状虽然表现出肌力降低，但通常比DMD轻，肌力降低的发展慢，在多数情况下在成年期发病。可以认为DMD与BMD的临床症状的不同在于，由于变异，在抗肌萎缩蛋白的mRNA翻译为抗肌萎缩蛋白时，氨基酸可读框被破坏或保持(非专利文献1)。即，对于DMD而言，由于存在氨基酸可读框错位的变异，因此基本上不表达保持功能的抗肌萎缩蛋白，但对于BMD而言，由于变异而使外显子的一部分缺失，但保持了氨基酸可读框，因此可以产生虽然不完全但是有功能的抗肌萎缩蛋白。
[0006]期待着外显子跳读法作为DMD的治疗方法。该方法是通过改变剪接而修复抗肌萎缩蛋白的mRNA的氨基酸可读框，从而诱导表达部分恢复了功能的抗肌萎缩蛋白的方法(非专利文献2)。成为外显子跳读的对象的氨基酸序列部分被丢失。因此，在该治疗中表达的抗肌萎缩蛋白比正常的抗肌萎缩蛋白短，但由于保持了氨基酸可读框，因此部分保持了使肌细胞稳定的功能。由此期待通过外显子跳读能使DMD表现出与更轻症状的BMD相同的症状。外显子跳读法经过动物实验，已经在进行对人DMD患者的临床试验。
[0007]可以通过以5
’
或3
’
剪接点中任一者或两者、或者外显子的内部为目标的反义核酸的结合来诱导外显子跳读。外显子仅在两个剪接点通过剪接体复合体进行识别的情况下包含在mRNA中。因此，通过利用反义核酸以剪接点为靶向可以诱导外显子跳读。另外可以认
为，由于外显子被剪接机构所识别，因此需要将丝氨酸和精氨酸丰富的SR蛋白质结合于外显子剪接增强子(ESE)，以ESE为靶向也能够诱导外显子跳读。
[0008]抗肌萎缩蛋白基因的变异根据DMD患者而有所不同，因此需要与基因变异的部位、种类相对应的反义核酸。对于抗肌萎缩蛋白基因的单一外显子，以一个连续的序列作为目标来诱导外显子跳读的反义核酸已有多个报告(专利文献1～6及非专利文献1和2)。另外，将以抗肌萎缩蛋白基因的同一外显子作为目标的两种反义核酸进行混合而使其发挥作用(双重靶向)时，跳读活性比单独使用各反义核酸的情况有所增强，对于这种情况也已有报告(专利文献7)。
[0009]但是，以同一外显子内的2个以上部位为目标的连接的单链反义核酸(连接型)显示出跳读活性的情况尚未报告(专利文献1)。
[0010]现有技术文献
[0011]专利文献
[0012]专利文献1：国际公开公报第2004/048570号
[0013]专利文献2：国际公开公报第2009/139630号
[0014]专利文献3：国际公开公报第2010/048586号
[0015]专利文献4：美国专利公开公报第2010/0168212号
[0016]专利文献5：国际公开公报第2011/057350号
[0017]专利文献6：国际公开公报第2006/000057号
[0018]专利文献7：国际公开公报第2007/135105号
[0019]非专利文献
[0020]非专利文献1：Annemieke Aartsma
‑
Rus et al.,(2002)Neuromuscular Disorders 12:S71
‑
S77
[0021]非专利文献2：Wilton S.D.,et al.,Molecular Therapy 2007:15:p.1288
‑
96

技术实现思路

[0022]专利技术要解决的课题
[0023]鉴于上述情况，本专利技术的主要目的在于提供一种以抗肌萎缩蛋白基因的同一外显子内2个不同部位的碱基序列为目标来诱导外显子跳读的新型连接型反义低聚物及包含该低聚物的肌营养不良症治疗药。
[0024]解决课题的方法
[0025]本专利技术人等对上述文献中记载的
技术实现思路
和抗肌萎缩蛋白基因的结构等进行了深入研究，结果发现将以人抗肌萎缩蛋白基因的外显子45中不同的2个部位作为目标的低聚物进行连接而得到的反义低聚物能够诱导该外显子的跳读。本专利技术人等基于该见解而完成了本专利技术。
[0026]即，本专利技术如下所述。
[0027][1][0028]一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是选自下述(a)～(e)的2个单元低聚物连接而成的14～32个碱基的长度的反义低聚物：
[0029](a)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第
‑
5～15号核苷酸
序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；
[0030](b)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第48～70号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；
[0031](c)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第128～150号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；
[0032](d)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第15～40号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；以及
[0033](e)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是由下述(a)单元低聚物与选自(b)～(e)中的一个单元低聚物连接而成的14～32个碱基的长度的反义低聚物：(a)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第
‑
5～15号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(b)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第48～70号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(c)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第128～150号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(d)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第15～40号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；以及(e)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第110～125号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物，其中，2个单元低聚物不连续。2.一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是由下述(b)单元低聚物与选自(c)～(e)中的一个单元低聚物连接而成的14～32个碱基的长度的反义低聚物：(b)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第48～70号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(c)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第128～150号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(d)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第15～40号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；以及(e)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第110～125号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物，其中，2个单元低聚物不连续。3.一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是由下述(c)单元低聚物与选自(d)～(e)中的一个单元低聚物连接而成的14～32个碱基的长度的反义低聚物：(c)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第128～150号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；(d)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第15～40号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物；以及(e)由与选自从人抗肌萎缩蛋白基因第45号外显子的5
’
末端起第110～125号核苷酸序列的连续7～16个碱基的核苷酸序列互补的碱基序列所构成的单元低聚物，其中，2个单元低聚物不连续。4.一种反义低聚物或者其医药上能够允许的盐或水合物，其是由下述(d)单元低聚物与(e)单元低聚物连接而成的14～32个碱基的长度的反义低...

【专利技术属性】
技术研发人员：盐谷由辉子，户根悠一郎，武田伸一，青木吉嗣，
申请(专利权)人：国立研究开发法人国立精神神经医疗研究中心，
类型：发明
国别省市：