一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法技术

本发明专利技术涉及一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法，属于细胞培养技术领域。本发明专利技术所述培养基包括：DMEM

【技术实现步骤摘要】
一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法


[0001]本专利技术涉及细胞培养
，具体涉及一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法。

技术介绍

[0002]间充质干细胞(MSC)是用于细胞治疗的候选者，在大多数情况下，治疗反应显示出具有细胞剂量依赖性。大多数应用针对MSC介导的组织修复或免疫调节，在许多应用中与自体MSC细胞相比，同种异体MSC更具有经济优势，可以从单一组织来源大规模制备大量细胞制剂用于更多的患者。人类足月胎盘组织富含MSC，是一种物理上很大的组织，通常在胎儿出生后被丢弃。胎盘是大规模生产多细胞剂量的同种异体MSC的理想起始材料。
[0003]在MSC细胞疗法的发展过程历史中，临床前和临床研究起初使用骨髓来源的MSC。(1)骨髓通常从志愿者捐献的髂嵴获得，这个过程是侵入性的，通过一次穿刺仅能收集少量的骨髓(20mL)。(2)基于此产生具有临床应用意义的MSC需要长时间的体外扩增。细胞效力在扩增过程中随着第三代(P3)细胞传代而降低，从而产生了一个悖论，即临床疗效所需的理论细胞数量随着细胞数量的扩大而增加。相比于骨髓抽吸物，足月胎盘是体积较大的起始组织(通常为500～750g)，可以在剖宫产期间进行无菌采集，对供体没有风险。同时，(1)源于胎盘的MSC具有长期增殖和免疫调节能力，优于骨髓来源的MSC。(2)一个足月胎盘含有足够的MSC，可用于制备多达7000次临床应用剂量。这些特性使得胎盘成为制备同种异体MSC的理想组织来源。
[0004]胎盘是一种胎儿母体器官，由胎儿和母体组织组成，因此理论上可以分离出胎儿或母体来源的MSC。胎盘本身主要由胎儿血管和成为滋养层的分泌和支持细胞组成，构成被绒毛膜板覆盖的绒毛膜绒毛。分枝的胎盘绒毛浸在从子宫螺旋动脉输送的母血中，保证胎儿和母亲之间进行营养、激素和气体交换。胎盘通过母体蜕膜基质细胞固定在子宫内膜上，胎儿绒毛外滋养层散布在细胞外基质中，绒毛会聚在胎儿绒毛膜板上，形成脐带。
[0005](1)对于胎盘MSC的分离和表征需要进行标准化操作以确保用于临床细胞制剂制备工艺的稳定，同时(2)由于操作人员对于胎盘解刨结构、不同组织位置处理、MSC的分离手段的差异以及培养体系的不同，并不能从胎盘组织中获得目标数量的MSC。目前并没有一种方法能够有效获得可用于临床治疗用的大量的胎盘来源间充质干细胞。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基、试剂盒和培养方法。本专利技术所述优化培养基能够最大限度地提高胎盘来源MSC体外扩增效率并减少批次间细胞的差异，在更短的时间范围内达到临床相关的细胞数量，从而减少培养基消耗，降低大规模细胞制备及生产成本，多代次均能保持较好的表型一致性和三系分化潜能。
[0007]本专利技术提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基，所述培养基包括：
基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括DMEM
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low glucose、L
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谷氨酰胺和β
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巯基乙醇；所述血清替代物包括Knockout
TM
血清替代物；所述补充剂包括重组人FGF2蛋白、重组人FGF4蛋白、重组人PDGF AB蛋白、重组人EGF蛋白、重组人VEGF 165A蛋白、重组人HGF蛋白、重组人TGF
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beta 1蛋白、烟酰胺单核苷酸和非必需氨基酸。
[0008]优选的是，所述基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90:9:1；所述优化培养基中，L
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谷氨酰胺的物质的量浓度为6mM、β
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巯基乙醇的物质的量浓度为0.15mM、重组人FGF2蛋白的质量浓度为30ng/mL、重组人FGF4蛋白的质量浓度为20ng/mL、重组人PDGFAB蛋白的质量浓度为6.0ng/mL、重组人EGF蛋白的质量浓度为2.0ng/mL、重组人VEGF 165A蛋白的质量浓度为0.4ng/mL、重组人HGF蛋白的质量浓度为0.4ng/mL、重组人TGF
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beta 1蛋白的质量浓度为1.0ng/mL、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为4mM和非必需氨基酸的体积百分含量为1％。
[0009]本专利技术还提供了一种培养人源胎盘来源间充质干细胞的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述的优化培养基、组织消化液、红细胞裂解液和培养皿；所述组织消化液包括100U/mL Collagenase type I、1.5μg/mL DNase I和2.4U/mL Dispase。
[0010]本专利技术还提供了一种人源胎盘来源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：
[0011]1)将预处理的胎盘组织与组织消化液混合，37℃消化2～3h，中止消化，得到消化后胎盘组织细胞悬液；
[0012]2)将消化后的胎盘组织细胞悬液进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液，离心，得到单个核细胞沉淀；
[0013]3)将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合进行红细胞的裂解，得到胎盘组织细胞；
[0014]4)将胎盘组织细胞重悬于上述技术方案所述的优化培养基中，得到胎盘组织细胞重悬液，将所述胎盘组织细胞重悬液接种到T
‑
175175培养瓶中进行培养，得到人源胎盘来源间充质干细胞。
[0015]优选的是，步骤1)所述预处理的胎盘组织的预处理方法包括：
[0016]以脐带为中心，从最接近脐带的区域剪切下半径为2～3cm的胎盘组织，剪掉脐带对侧胎盘组织，弃掉，将剩下的脐带侧胎盘组织剪为2～4cm的小块，使用HBSS溶液对小块进行洗涤，直至没有明显血液，得到洗涤后的组织块；将洗涤后的组织块切成2～5mm的细小块，得到预处理的胎盘组织。
[0017]优选的是，步骤2)所述过滤包括：将消化后的胎盘组织进行过滤，得到含有单个核细胞的细胞悬液和未消化的胎盘组织碎片；将所述未消化的胎盘组织碎片悬浮后再次过滤，收集含有单个核细胞的细胞悬液；所述过滤的次数为2～3次。
[0018]优选的是，步骤3)所述裂解包括：将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合后反复吹打2～3min，离心后弃上清；取沉淀再次与红细胞裂解液混合，反复吹打2～3min，离心弃上清，重复取沉淀和与红细胞裂解液混合、反复吹打和离心弃上清的操作，直至细胞沉淀中看不到明显的红色血细胞。
[0019]优选的是，步骤4)中，所述接种的密度为6
×
106个细胞/T
‑
175培养瓶；所述培养的
条件为37℃和5％CO2加湿培养。
[0020]优选的是，步骤4)所述培养包括：培养48h后，使用新鲜的优化培养基进行半量换液，再培养24h后，使用37℃预热的D
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PBS洗涤，去除非贴壁细胞和细胞碎屑，加入新的优化培养基，之后，每3天全量更换新的优化培养基一次，直至细胞单层铺满T
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175培养瓶90％以上本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种人源胎盘来源间充质干细胞的优化培养基，其特征在于，所述培养基包括：基础培养基、血清替代物和补充剂；所述基础培养基包括DMEM
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low glucose、L
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谷氨酰胺和β
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巯基乙醇；所述血清替代物包括Knockout
TM
血清替代物；所述补充剂包括重组人FGF2蛋白、重组人FGF4蛋白、重组人PDGFAB蛋白、重组人EGF蛋白、重组人VEGF 165A蛋白、重组人HGF蛋白、重组人TGF
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beta 1蛋白、烟酰胺单核苷酸和非必需氨基酸。2.根据权利要求1所述的优化培养基，其特征在于，所述基础培养基、血清替代物和补充剂的体积比为90:9:1；所述优化培养基中，L
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谷氨酰胺的物质的量浓度为6mM、β
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巯基乙醇的物质的量浓度为0.15mM、重组人FGF2蛋白的质量浓度为30ng/mL、重组人FGF4蛋白的质量浓度为20ng/mL、重组人PDGFAB蛋白的质量浓度为6.0ng/mL、重组人EGF蛋白的质量浓度为2.0ng/mL、重组人VEGF 165A蛋白的质量浓度为0.4ng/mL、重组人HGF蛋白的质量浓度为0.4ng/mL、重组人TGF
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beta 1蛋白的质量浓度为1.0ng/mL、烟酰胺单核苷酸的物质的量浓度为4mM和非必需氨基酸的体积百分含量为1％。3.一种培养人源胎盘来源间充质干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1或2所述的优化培养基、组织消化液、红细胞裂解液和培养皿；所述组织消化液包括100U/mL Collagenase typeI、1.5μg/mLDNase I和2.4U/mLDispase。4.一种人源胎盘来源间充质干细胞的培养方法，包括以下步骤：1)将预处理的胎盘组织与组织消化液混合，37℃消化2～3h，中止消化，得到消化后胎盘组织细胞悬液；2)将消化后的胎盘组织细胞悬液进行过滤，得到含有单核细胞的细胞悬液，离心，得到单个核细胞沉淀；3)将单个核细胞沉淀与红细胞裂解液混合进行红细胞的裂解，得到胎盘组织细胞；4)将胎盘组织细胞重悬于权利要求1或2所述的优化培养基中，得到胎盘组织细胞重悬液，将所述胎盘组织细胞重悬液接种到液，将所述胎盘组织细...

【专利技术属性】
技术研发人员：雷欣华，金倞，梁磊，
申请(专利权)人：北京吉中科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：