一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法，涉及苹果潜隐球状病毒检测技术领域。本发明专利技术提供的检测引物组合物，可以特异性地实现目标样本中苹果潜隐球状病毒ALSV的检出，且这4条引物靶向识别ALSV CP靶基因的6个序列，特异性强，准确性高。提供的检测卡可以用于目标样本中苹果潜隐球状病毒ALSV的快速检出，适用于田间等基层使用。本发明专利技术提供的检测试剂盒及检测方法具有操作简单、准确度高、适用性好的技术优势。适用性好的技术优势。适用性好的技术优势。

【技术实现步骤摘要】
一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法


[0001]本专利技术涉及苹果潜隐球状病毒检测
，具体而言，涉及一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法。

技术介绍

[0002]苹果潜隐球状病毒(Apple latent sephical virus，ALSV)属于伴生豇豆病毒科(Secoviridae)，樱桃锉叶病毒属(Cheravirus)，它的寄主范围很广，包括烟草、番茄、马铃薯、黄瓜、甜瓜、西葫芦、大豆，豌豆和蚕豆、苹果、梨、桃子、李子等。在侵染黎麦和大豆初期，引起褪绿斑症状，其它寄主通常表现为隐症，不会引起明显的病毒侵染症状。在苹果中可通过种子和花粉传播。
[0003]ALSV病毒粒子为球形，直径约为25nm，由一个双片段的单链RNA基因组(RNA1和RNA2)和三种外壳蛋白(Vp25、Vp20和Vp24)组成。RNA1编码RNA依赖性RNA聚合酶、半胱氨酸聚合酶、VPg和三磷酸核苷酸结合结构域(NTP binding domain)，RNA2编码运动蛋白和外壳蛋白。
[0004]目前，针对ALSV病毒的检测方法主要有逆转录聚合酶链式反应(RT
‑
PCR)等技术，但该方法存在检测程序复杂、检测费用高、对仪器设备和检测条件要求高等问题，需要长期经验积累和具有专业操作技能的人员才能完成，因此使用范围受到很大的局限，无法满足种植现场及田间快速检测的需求。此外，种子病毒含量低，RNA提取难度大，依赖于核酸提取的RT
‑
PCR及其衍生技术检测的准确性受到影响，急需开发出适用于种子病毒病害快速、灵敏检测的新技术和新方法。
[0005]鉴于此，特提出本专利技术。

技术实现思路

[0006]本专利技术的目的在于提供一种苹果潜隐球状病毒的检测试剂盒和检测方法以解决上述问题。
[0007]本专利技术是这样实现的：
[0008]本专利技术提供了一种引物组合物，其用于苹果潜隐球状病毒检测，其包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP、SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP。
[0009]序列如下：
[0010]F3：5
’‑
CCTGCGAATATTATAAATCTAGCAT
‑3’
；
[0011]B3：5
’‑
CTGTACATATTACTGGTAAAACACA
‑3’
；
[0012]FIP：
[0013]5’‑
TTGTGCGCTCATCTTGAGGGGAGCAGGTAACAAGCCAAT
‑
3'；
[0014]BIP：
[0015]5’‑
CAGTGCCTAAATCAAATGGGTTAAAGCAACTTTCTATAGGCCCTAA
‑3’
。
[0016]上述引物组合物可以用于RT
‑
LAMP反应，RT
‑
LAMP反应通过F3、B3、FIP和BIP共4条特异性引物识别ALSV CP靶基因的6个序列，具有特异性强和准确性高的优势。需要说明的是，上述引物组合物是专利技术人经过长期大量的扩增筛选，获得的一组具有高特异性、较好重复率和高灵敏度的检测引物组合。
[0017]由上述引物组合物制备的试剂可以是冻干粉状，按照引物的上下游及类型各自单独分装于储存管中。
[0018]本专利技术还提供了一种苹果潜隐球状病毒的检测卡，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，胶体金结合垫上含有胶体金
‑
苹果潜隐球状病毒抗体的结合物，硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，检测T线包被有ALSV的抗体IgG，质控C线包被有抗ALSV抗体的二抗；检测T线上ALSV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；抗ALSV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白。
[0019]胶体金结合垫上的苹果潜隐球状病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含15
‑
16μg的苹果潜隐球状病毒抗体。
[0020]专利技术人提供的上述检测卡可以实现苹果潜隐球状病毒ALSV的快速筛查，适用于田间等情形下的实地快速筛检。方便携带，且无需特定的设备或仪器，通过肉眼即可判断目标样本是否感染苹果潜隐球状病毒，具有良好的应用前景。
[0021]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，卡槽具有放置衬板的安装腔，衬板与下壳体的内壁固定连接，上壳体与下壳体固定连接。
[0022]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，加样窗空间上位于样品垫的上方以便于上样于样品垫上用于后续的毛细层析，反应观察窗空间上位于硝酸纤维素膜的上方以利于后续的。
[0023]在一种实施方式中，上壳体与下壳体通过卡扣结构卡接。在其他实施方式中，上壳体与下壳体的连接方式也可以是粘接、固定件固接等方式。
[0024]本专利技术还提供了一种用于检测苹果潜隐球状病毒的GICA
‑
RT
‑
LAMP试剂盒，其包括苹果潜隐球状病毒的检测卡和用于苹果潜隐球状病毒检测的引物组合物。
[0025]在本专利技术应用较佳的实施方式中，上述试剂盒还包括RT
‑
LAMP扩增反应试剂，RT
‑
LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶和水；优选地，反转录酶选自AMV反转录酶或M
‑
MLV反转录酶，反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液。
[0026]通过上述的特异性内引物FIP/BIP和外引物F3/B3，靶向目的序列六个特异性区域，利用具有链置换特点的DNA聚合酶，合成循环模板进行扩增反应。LAM具有扩增效率高的优势，能在约1h时间内获得109‑
10
10
个拷贝。与常规PCR核酸检测方法相比，LAMP技术无需基因扩增仪等分子生物学仪器设备，其在恒温水浴中即能完成扩增反应，具有操作简便、特异性强、灵敏度高等优势。
[0027]在一种可选的实施方式中，试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品。
[0028]在一种可选的实施方式中，阴性对照品为水，阳性对照品为苹果潜隐球状病毒外
壳蛋白CP基因片段标准品。
[0029]当归ALSV CP基因片段标准品的序列如下：
[0030]TTGTATCAACCGTTCCTCCTGAAAATTTTTCAAAGGAGTAATTATCAGTACRCTGCGKAATATTATAYAAKTCTAGCATTAGTGAGGGCTGAGCAGGTAACAAGCCAATTTACGACCAA本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，其用于苹果潜隐球状病毒检测，其特征在于，其包括如SEQ ID NO.1所示的正向外引物F3、SEQ ID NO.2所示的反向外引物B3、SEQ ID NO.3所示的正向内引物FIP和SEQ ID NO.4所示的反向内引物BIP。2.一种苹果潜隐球状病毒的检测卡，其特征在于，其包括在衬板上依次设置的样品垫、胶体金结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫，所述胶体金结合垫上含有胶体金
‑
苹果潜隐球状病毒抗体的结合物，所述硝酸纤维素膜上沿层析方向依次设置有检测T线和质控C线，所述检测T线包被有ALSV的抗体IgG，所述质控C线包被有抗ALSV抗体的二抗；所述检测T线上ALSV的抗体IgG的包被量为每2mm线宽上包被1.0～1.5μg蛋白；所述抗ALSV抗体的二抗的包被量为每2mm线宽上包被1.5～2.0μg蛋白；所述胶体金结合垫上的苹果潜隐球状病毒抗体的包被量为每1mL胶体金中含15
‑
16μg的苹果潜隐球状病毒抗体。3.根据权利要求2所述的苹果潜隐球状病毒的检测卡，其特征在于，所述检测卡还包括由下壳体和上壳体组成的卡槽，所述卡槽具有放置所述衬板的安装腔，所述衬板与所述下壳体的内壁固定连接，所述上壳体与所述下壳体固定连接。4.根据权利要求3所述的苹果潜隐球状病毒的检测卡，其特征在于，所述上壳体上间隔设置有加样窗和反应观察窗，所述加样窗空间上位于所述样品垫的上方，所述反应观察窗空间上位于所述硝酸纤维素膜的上方；优选地，所述上壳体与所述下壳体通过卡扣结构卡接。5.一种用于检测苹果潜隐球状病毒的GICA
‑
RT
‑
LAMP试剂盒，其特征在于，其包括权利要求2
‑
4任一项所述的苹果潜隐球状病毒的检测卡和权利要求1所述的用于苹果潜隐球状病毒检测的引物组合物。6.根据权利要求5所述的检测苹果潜隐球状病毒的GICA
‑
RT
‑
LAMP试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括RT
‑
LAMP扩增反应试剂，所述RT
‑
LAMP扩增反应试剂包括反转录酶、RNase抑制剂、dNTP混合物、反应缓冲液、MgSO4、DNA聚合酶和水；优选地，所述反转录酶选自AMV反转录酶或M
‑
MLV反转录酶，所述反应缓冲液选自ThermoPol反应缓冲液；优选地，所述试剂盒还包括磷酸缓冲液、磷酸洗涤缓冲液、荧光染料检测液、阴性对照品和阳性对照品；优选地，所述阴性对照品为水，所述阳性对照品为苹果潜隐球状病毒外壳蛋白CP基因片段标准品；优选地，所述DNA聚...

【专利技术属性】
技术研发人员：张玉宝，王若愚，谢忠奎，王亚军，金卫杰，何玉惠，
申请(专利权)人：中国科学院西北生态环境资源研究院，
类型：发明
国别省市：