一种衍生化-串联液质联用测定还原糖含量的方法技术

本发明专利技术提供一种衍生化

【技术实现步骤摘要】
一种衍生化
‑
串联液质联用测定还原糖含量的方法


[0001]本专利技术涉及还原糖测定
，具体涉及一种衍生化
‑
串联液质联用测定还原糖含量的方法。

技术介绍

[0002]糖类化合物存在于所有的生物体中，主要用作能量来源，结构物质和功能性物质，在各种生物过程中起着关键的作用。糖类物质在诸多生命过程，如受精、生长、分化、发育、信号转导和免疫应答等方面起着重要的作用。建立高通量的定性定量检测糖的方法，有利于深入理解糖的生物学功能。
[0003]随着液质联用技术的广泛应用，液相色谱结合常用的电喷雾电离方式被广泛应用于糖类化合物的检测。但是由于糖类物质在常见的电喷雾离子源条件下电离化效率差，难以实现对于低浓度含量还原糖化合物的检测，这在很大程度上限制了液质联用技术对该类物质的灵敏分析。
[0004]为提高糖类物质的电离化效率，在质谱检测前通常需对其进行衍生化处理。目前常用的衍生化方法主要有还原端羟基的甲基化、乙酰化反应，该类反应针对羟基进行衍生，反应时间长，且难以保证羟基全部反应；吡唑啉酮衍生化，还原胺化反应，以及肼、酰肼与还原糖衍生化成腙反应，这三类反应针对还原端半缩醛进行衍生，但衍生后需进行除盐和样品的纯化等步骤，过程繁琐，易造成样品的损失。因此，开发探索新的衍生化策略，对实现低浓度还原糖的高灵敏度定性定量检测具有重要的价值。

技术实现思路

[0005]为了解决上述问题，本专利技术提供一种衍生化
‑
串联液质联用测定还原糖含量的方法，包括如下步骤：
[0006](1)标准曲线的绘制：配制不同还原糖含量的标准溶液，氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物标准溶液，通过串联液质联用检测，得到衍生产物离子信号的色谱峰面积值和还原糖含量的标准曲线；
[0007](2)还原糖含量的测定：将样品氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物样品溶液，通过串联液质联用检测，得到样品中还原糖含量。
[0008]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述还原糖选自葡萄糖及其衍生物、核糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物和麦芽三糖及其衍生物、1
‑
甲基
‑3‑
吡喃葡萄糖及其衍生物中的一种或几种。
[0009]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(1)中，还原糖和二苄胺的摩尔比为1：(0.5～100)。
[0010]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述稀释剂包括:有机溶剂、酸和水，加入稀释剂后，所述二苄胺的浓度为0.5～50mmol/L。
[0011]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述稀释剂中的酸选自甲酸、乙酸、盐酸、硫酸和磺酸中的一种或多种；更进一步地，所述酸溶液中的酸选自甲酸和乙酸中的至少一种。
[0012]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述稀释剂中的有机溶剂选自乙腈、乙醇、甲醇、异丙醇、丁醇和乙二醇中的一种或几种。
[0013]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述稀释剂中酸的体积百分数为0.01～20％。
[0014]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述稀释剂中水的体积百分数为0.01～20％。
[0015]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述步骤(1)和步骤(2)反应的衍生化反应温度和时间相同，所述反应的温度为60～80℃，反应的时间为0.5～5h。
[0016]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述串联液质联用的色谱柱为C18、C8和C4柱中的一种；流动相包括流动相A和流动相B，所述流动相A选自甲醇、乙醇和乙腈中的一种或几种，优选地为乙腈，所述流动相B为水。所述流动相A和流动相B中还包括体积比为0.05～0.5％的酸；优选地所述流动相中酸为甲酸、乙酸中的一种或两种。
[0017]作为本专利技术一种优选的技术方案，所述串联液质联用质谱为液相色谱联用常用的质谱，如四极杆质谱、飞行时间质谱、离子阱质谱或轨道离子阱质谱。
[0018]本专利技术还提供一种所述的衍生化
‑
串联液质联用测定还原性糖含量的方法的应用，用于糖含量的测定。
[0019]本专利技术与现有技术相比具有以下有益效果：
[0020](1)本专利技术通过还原性糖和二苄胺在酸溶液中进行衍生反应，具体地，利用还原性末端羟基和二苄胺的氨基发生加成脱水，生成衍生产物，并对衍生产物进行测量，具有衍生程序简便、快速、重现性好的优势；
[0021](2)本专利技术通过串联液相色谱质谱进行检测，具有灵敏度高，专属性强，测试效率高的特点；
[0022](3)本专利技术衍生化试剂二苄胺中所带氮元素，很容易地在正ESI模式下质子化，显著提高了还原糖在ESI模式下的离子化效率，有效的解决了还原糖类化合物因离子化效率低，低浓度难以检测的问题。
[0023](4)本方法线性在0.2
‑
20ppb范围内与质谱响应呈良好的线性关系，根据3倍于噪声的峰高的灵敏度确认方法，可得到本专利技术提供的方法的灵敏度约为0.01ppb。
附图说明
[0024]图1为实施例3中检测得到的糖标准溶液质谱图。
[0025]图2为实施例3中检测得到的实际样品中目标化合物的色谱图。
[0026]图3为实施例3中检测得到的葡萄糖标准溶液的标准曲线。
具体实施方式
[0027]一种衍生化
‑
串联液质联用测定糖含量的方法，包括：
[0028](1)标准曲线的绘制：配制不同含量的糖标准溶液，氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物标准溶液，通过串联液质联用检测，得到衍生产物离子信号的色谱峰面积值和还原糖含量的标准曲线；
[0029](2)糖含量的测定：将样品氮气吹干，加入二苄胺(衍生化试剂)和稀释剂，进行衍
生化反应，得到衍生产物样品溶液，通过串联液质联用检测，得到样品中糖的含量。
[0030]步骤(1)本专利技术利用糖的还原性末端羟基和衍生化试剂二苄胺的氨基发生加成脱水，生成衍生产物进行反应。
[0031]步骤(2)本专利技术在对样品中糖含量进行检测时，通过采用和标准溶液进行检测相同的衍生反应和测定参数进行测试，得到样品中衍生产物的糖含量，并和标准曲线进行对比，得到样品中糖含量，本专利技术不对样品做具体限定，可为生物发酵液，生物样品，反应溶液。
[0032]液质联用检测的条件为：液相条件：色谱柱：极性C18色谱柱(2.1mm
×
150mm，3μm)，流动相A为乙腈(含0.1％甲酸)，B为去离子水(含0.1％甲酸)，流速为0.2mL/min。洗脱梯度为：0
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6min,A/B(v/v):10:90
→
10:90；6
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11min,10:90
→
90:10；11
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种衍生化
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串联液质联用测定还原糖含量的方法，其特征在于：包括如下步骤：S1.标准曲线的绘制：配制不同还原糖含量的标准溶液，氮气吹干，加入二苄胺和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物标准溶液，通过串联液质联用检测，得到衍生产物离子信号的色谱峰面积值和还原糖含量的标准曲线；S2.还原糖含量的测定：将样品氮气吹干，加入二苄胺和稀释剂，进行衍生化反应，得到衍生产物样品溶液，通过串联液质联用检测，得到样品中还原糖含量。2.如权利要求1所述的一种衍生化
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串联液质联用测定还原糖含量的方法，其特征在于：所述还原糖选自葡萄糖及其衍生物、核糖及其衍生物、半乳糖及其衍生物、木糖及其衍生物、阿拉伯糖及其衍生物、甘露糖及其衍生物、麦芽糖及其衍生物和麦芽三糖及其衍生物、1
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甲基
‑3‑
吡喃葡萄糖及其衍生物中的一种或几种。3.如权利要求1所述的一种衍生化
‑
串联液质联用测定还原糖含量的方法，其特征在于：所述步骤S1中，还原糖和二苄胺的摩尔比为1：0.5～100。4.如权利要求1所述的一种衍生化
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串联液质联用测定还原糖含量的方法，其特征在于：所述稀释剂包括有机溶剂、...

【专利技术属性】
技术研发人员：万慧慧，叶凡凡，唐泽坤，宋玉明，徐强，张华，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：