一种细胞因子检测试剂盒的开发方法技术

本发明专利技术公开了一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。本发明专利技术中，加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2

【技术实现步骤摘要】
一种细胞因子检测试剂盒的开发方法


[0001]本专利技术属于细胞因子
，具体为一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。

技术介绍

[0002]细胞因子是指由免疫细胞(如T细胞、B细胞、NK细胞等)和某些非免疫细胞(内皮细胞、表皮细胞、纤维母细胞等)经刺激而合成、分泌的一类具有广泛生物学活性的小分子蛋白质。细胞因子可被分为白细胞介素、干扰素、肿瘤坏死因子超家族、集落刺激因子、趋化因子、生长因子等，具有调节固有免疫和适应性免疫、血细胞生成、细胞生长以及损伤组织修复等多种功能。检测细胞因子水平可用来监测人体的免疫状态，辅助各类疾病(如炎症、肿瘤、自身免疫病和移植排斥等)的诊断及预后。但由于检测的细胞因子较多，如果采用单个因子检测，需要大量的样本，且总的操作时间较长，影响临床诊断出具报告的及时性。当前检测多因子的仪器有Luminex和流式，采用的编码微球有磁性和非磁性两种，磁性的微球为粒径相同的二维荧光编码微球，通过两种不同的荧光染料组合进行区分，理论上可同时检测数百种因子，非磁性的微球通常为2种不同粒径的一维荧光编码微球，可检测几十种因子。
[0003]但是常见的检测试剂盒在准确度、灵敏度、特异性方面都不够高，从而使得检测时不够精确。

技术实现思路

[0004]本专利技术的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种细胞因子检测试剂盒的开发方法。
[0005]本专利技术采用的技术方案如下：一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：
[0006]S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；
[0007]S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
[0008]S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES溶液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo
‑
NHS，涡旋振荡混匀；
[0009]S4:室温避光振荡孵育20分钟，孵育结束后，1000
×
g离心10分钟，弃上清
[0010]S5:加入50mMMES重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对溶液重复洗涤一次备用；
[0011]S6:取70～～90μl抗人IL
‑
6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；
[0012]S7:将脱盐后的IL
‑
6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等
其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；
[0013]S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球溶液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
[0014]S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在
±
15％以内；确定线性范围和最低检测限；
[0015]S10:测试重复性、分析特异性测试标曲变异系数，应小于15％；
[0016]S11:降低多个因子组合后的干扰影响；测试每个因子单独检测和组合检测，对结果的影响，并根据结果进行优化，使干扰影响降至最低；
[0017]S12:测试产品各组分的形式及保存稳定性；测试各组分的保存形式，以及在2
‑
8度下的稳定性，未开封应至少保存18个月，开封后保存30天，从而完成细胞因子检测试剂盒的开发。
[0018]在一优选的实施方式中，所述步骤S3中，旋振荡的时间为35秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1200xg。
[0019]在一优选的实施方式中，所述步骤S8中，用封闭液离心洗涤两次备用之后加入250～～300μl封闭液重悬，流式上机计数。
[0020]在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，不同的样本类型包括如血清、血浆、EDTA抗凝、肝素钠抗凝、柠檬酸钠抗凝。
[0021]在一优选的实施方式中，所述步骤S10中，测试每个因子受样本干扰因素的影响，如甘油三酯应小于等于10mM、血红蛋白应小于等于5.0mg/ml、胆红素应小于等于10mM258μM。
[0022]在一优选的实施方式中，所述步骤S5中，旋振荡的时间为40秒，超声处理的时间为25秒，离心的速度控制为900xg。
[0023]在一优选的实施方式中，所述步骤S8中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
[0024]在一优选的实施方式中，所述步骤S9中，封闭液为99.88％PBS溶液、0.1％BSA溶液和0.02％Tween20溶液的混合物，离心洗涤的速率为控制为1000xg。
[0025]综上所述，由于采用了上述技术方案，本专利技术的有益效果是：
[0026]1、本专利技术中，实现自主标记微球、搭配组合检测因子，形成适应市场需求的产品，为进入临床市场打下基础，并在国内同行业中处于领先地位；与商品化的产品相比，在准确度、灵敏度、特异性、稳定性、检测因子数量等方面接近或达到国内外厂家的领先水平。
具体实施方式
[0027]为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本专利技术实施例，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。
[0028]实施例：
[0029]一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：
[0030]S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；
[0031]S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；
[0032]S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES溶液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo
‑
NHS，涡旋振荡混匀；所述步骤S3中，旋振荡的时间为35秒，超声处理的时间为30秒，离心的速度控制为1200xg；
[0033]S4:室温避光振荡孵育2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种细胞因子检测试剂盒的开发方法，其特征在于：所述细胞因子检测试剂盒的开发方法包括以下步骤：S1:查找合适的荧光编码微球；根据拟开发产品所检测的因子数量及适用仪器，确定合适的荧光编码微球；S2:摸索微球标记抗体的方法；取来离心机和50μl微球，将微球加入到离心机的内部，开始对微球进行离心操作，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；S3:加入80μl 50mM且pH为5.0MES液，涡旋振荡20秒，超声20秒，加入10μl 50mg/ml EDC和10μl 50mg/ml sulfo
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NHS，涡旋振荡混匀；S4:孵育结束后，1000
×
g离心10分钟，弃上清；S5:加入50mMMES重悬沉淀，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后使用清水再对液重复洗涤一次备用；S6:取70～～90μl抗人IL
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6抗体，加入脱盐柱脱盐一次；S7:将脱盐后的IL
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6抗体加入微球中，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，等其混合均匀之后，室温避光振荡孵育2小时；S8:加入封闭液，使用涡旋振荡机对其进行涡旋振荡处理，之后使用超声震荡机对其进行超声震荡处理结束之后，将微球液加入到离心机的内部，对其进行离心处理，离心过程结束之后，取出离心液中的上清液，将其废弃不用；之后就可以结束标记抗体的过程；S9:筛选标准品稀释液，测试样本类型，确定线性范围、最低检测限，测试准确度筛选标准品稀释液，测试不同的样本类型，使检测结果的相对偏差在
±
15％以内；确定线性范围和最低检测限；S10:测试重复性、分析特异性测试标曲变异系数，应小于15％；...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋路红，
申请(专利权)人：杭州联科生物技术股份有限公司，
类型：发明
国别省市：