低刺激性的凝集素磁珠及重组凝集素磁珠的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种低刺激性的凝集素磁珠，由磁珠及与磁珠共价结合的带有标签的凝集素蛋白组成，所述磁珠为SNAP

【技术实现步骤摘要】
低刺激性的凝集素磁珠及重组凝集素磁珠的制备方法


[0001]本专利技术专利涉及一种低刺激性的凝集素磁珠及重组凝集素磁珠的制备方法，属于生物


技术介绍

[0002]凝集素是一类能够结合多糖基团的蛋白质，主要分布在细胞外基质中。细胞外基质中分布大量的糖蛋白和多糖基团，凝集素能够通过结合多糖基团来介导细胞之间的稳固连接。植物来源凝集素，如刀豆素A（Conconvalina，ConA）、麦胚素（Wheat germ agglutinin，WGA）、花生凝集素（Peanut agglutinin，PNA）和大豆凝集素（Soybean agglutinin，SBA）等，能够高效地结合多糖基团。因此，植物凝集素成为了捕获糖蛋白的重要生物学工具。
[0003]近年来，细胞分离及捕获技术成为许多生物学技术的核心点，包括CUT&RUN、CUT&Tag、ACT
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seq、FTCT
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seq和多类单细胞测序技术和单细胞核测序技术。这些技术都依赖于凝集素磁珠如ConA磁珠对细胞进行捕获，进而对捕获的细胞进行透化穿孔，以保证下游的反应液能够进入到细胞中进行反应。ConA磁珠可以对靶细胞进行快速的捕获分离，在细胞内反应过程中具有操作方便、损失小、不需要离心、细胞分离干净、不影响下游反应等明显的优势，尤其适用于低细胞投入量的细胞内反应捕获载体。
[0004]尽管ConA磁珠在捕获细胞上存在明显的优势，这种磁珠捕获细胞技术也存在很明显的缺点。为了实验目的需要，在细胞捕获过程中经常要求保证真实的细胞状态。因此ConA磁珠通常用于捕获未经固定处理的自然状态细胞，且捕获的时长通常高达多个小时甚至数天。这种长时间结合可能会造成显著的细胞压力和信号转导变化，对实验结果造成严重的干扰和破坏。市面上已有的ConA磁珠主要是利用链霉亲和素磁珠结合生物素偶联的刀豆素蛋白制备而成。这种方法制备的ConA磁珠细胞承载量小、对细胞压力和损伤大、容易板结，对细胞捕获下游实验具有很大的影响。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种低刺激性的凝集素磁珠。
[0006]本专利技术采取的技术方案为：一种低刺激性的凝集素磁珠，由磁珠及与磁珠共价结合的带有标签的凝集素蛋白组成，所述磁珠为SNAP
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Tag磁珠或Halo
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Tag磁珠，所述标签为对应的可耦合到磁珠上的SNAP标签或Halo标签，所述凝集素蛋白为刀豆素A或小扁豆凝集素。
[0007]优选的，所述带有标签的凝集素蛋白的序列如SEQ ID No.1
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4中任一项所述。
[0008]本专利技术还公开了一种重组凝集素磁珠的制备方法，其特征在于其步骤包括：（1）构建重组标签凝集素的原核表达载体，其中重组标签凝集素的序列如SEQ ID No.1
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4中任一项所示，表达重组标签凝集素的核苷酸序列如SEQ ID No.5
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8中任一项所示；（2）将重组标签凝集素原核表达载体转化到大肠杆菌表达宿主中；
（3）诱导表达重组标签凝集素，裂解细菌宿主；（4）用对应的磁珠结合细菌宿主裂解液；（5）清洗磁珠，获得重组凝集素磁珠。
[0009]本专利技术的有益效果为：本专利技术利用带有特定蛋白标签的凝集素蛋白共价结合到相对于的捕获磁珠上，这种结合方式制备的凝集素磁珠具有制备简单、成本低、细胞压力小、稳定性强、结合能力持久、细胞承载量大、损失小、不容易板结、对下游实验影响小等优势，非常适用于细胞捕获的实验需求。
附图说明
[0010]图1不同凝集素处理细胞后，细胞的全转录组表达相关性。左半个三角形是293F细胞的分析结果，右半边三角形是CHO细胞的分析结果。
[0011]图2不同磁珠处理细胞后，细胞的全转录组表达相关性。左半个三角形是293F细胞的分析结果，右半边三角形是CHO细胞的分析结果。
[0012]图3 不同凝集素链霉亲和素磁珠处理细胞后，细胞的全转录组表达与未处理组的相关性。
[0013]图4 不同凝集素链霉亲和素磁珠的细胞捕获效率比较。
[0014]图5 不同凝集素链霉亲和素磁珠的细胞捕获稳定性比较。
[0015]图6 不同凝集素磁珠处理细胞后，细胞的全转录组表达与未处理组的相关性。
[0016]图7 不同凝集素磁珠的细胞捕获效率比较。
[0017]图8 不同凝集素磁珠的细胞捕获稳定性比较。
[0018]图9 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠处理细胞后，细胞的全转录组表达与未处理组的相关性。
[0019]图10 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠的细胞捕获效率比较。
[0020]图11 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠的细胞捕获稳定性比较。
[0021]图12 磁珠结合细胞后分散均匀性比较。
[0022]图13 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠在FTCT
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seq上的文库产量比较。
[0023]图14 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠在FTCT
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seq上的文库电泳图。
[0024]图15 本专利技术制备的ConA磁珠与市面上已有的ConA磁珠在FTCT
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seq上的测序结果与ENCODE ChIP
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seq的相关性比较。
具体实施方式
[0025]通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本专利技术的特点和优点。所提供的实施例仅是对本专利技术方法的说明，而不以任何方式限制本专利技术揭示的其余内容。
[0026]实施例1：不同凝集素的细胞刺激性测试。
[0027]在本实施例中，我们测试了不同凝集素处理对细胞造成的压力，我们挑取的凝集素有刀豆素A、橙黄网孢盘菌凝集素、加纳籽凝集素、小扁豆凝集素、番茄凝集素、蓖麻凝集
素、麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素共9种凝集素，并将处理之后的基因谱表达变化作为响应细胞压力的检测指标，具体实施方式如下：分别取状态良好的100
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1000000个293F细胞和CHO细胞，用清洗缓冲液（20 mM HEPES(pH 7 .5)，150 mM NaCl，0.5 mM 亚精胺，1x Protease inhibitors cocktail）清洗2次后，悬浮到100 ul清洗缓冲液中。分别加入100 ng的刀豆素A、橙黄网孢盘菌凝集素、加纳籽凝集素、小扁豆凝集素、番茄凝集素、蓖麻凝集素、麦胚素、花生凝集素和大豆凝集素（均购买自VECTOR），对照加入等体积的清洗缓冲液，室温旋转孵育1天。孵育结束后，使用翌圣生物的细胞/组织总RNA提取试剂盒（19221）进行RNA提取，并使用MaxUp核糖体RNA去除试剂盒（12253）和双模式RNA 建库试剂盒（12252）进行去除核糖体RNA的全转录组建库。建好的文库在i本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种低刺激性的凝集素磁珠，由磁珠及与磁珠共价结合的带有标签的凝集素蛋白组成，所述磁珠为SNAP
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Tag磁珠或Halo
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Tag磁珠，所述标签为对应的可耦合到磁珠上的SNAP标签或Halo标签，所述凝集素蛋白为刀豆素A或小扁豆凝集素。2.根据权利要求1所述的低刺激性的凝集素磁珠，其特征在于：所述带有标签的凝集素蛋白的序列如SEQ ID No.1
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4中任一项所述。3.一种重组凝集...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋东亮，侯策，刘倩，孙睿，王嫚，江翱，陈晶晶，曹振，
申请(专利权)人：翌圣生物科技上海股份有限公司，
类型：发明
国别省市：