本发明专利技术公开了一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用，先建立PN/PDRN的DNA文库，自文库中选取出固定长度的PN/PDRN并进行连接产生多拷贝PN/PDRN片断，将多拷贝PN/PDRN片断转接到克隆载体取得重组PN/PDRN克隆载体；将重组PN/PDRN载体引入适合细菌宿主取得转化子，培养转化子使重组PN/PDRN克隆载体得以大量复制扩增，然后再从转化子内分离出重组PN/PDRN克隆载体，自重组PN/PDRN克隆载体中酶切取得固定长度的重组PN/PDRN片段。有别于传统自人类或动物细胞组织中提取PN/PDRN的方法，本方法制备所得固定长度的重组PN/PDRN，使生产效率大幅提高，不仅能避免使用人类或动物细胞组织材料的风险，也有高产量、低成本优势，可以运用于化妆品、保健品、医疗器械与医药品等用途，经济效益获得显着提升。升。升。
【技术实现步骤摘要】
一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用
[0001]本专利技术属于生物
，具体涉及一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法及其应用。
技术介绍
[0002]众所周知脱氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid,DNA)是包含人类在内多数生物体的遗传物质，负责生命遗传讯息的维持与传递；DNA是由四种脱氧核糖核苷酸所组成的大分子聚合物，脱氧核糖核苷酸是由脱氧核糖、碱基和磷酸所构成。脱氧核糖核苷酸有4种：腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(Adenine deoxyribonucleotide,A)、鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸(Guanine deoxyribonucleotide,G)、胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸(Thymine deoxyribonucleotide,T)和胞嘧啶脱氧核糖核苷酸(Cytosine deoxyribonucleotide,C)。DNA分子结构则由两股反向互补的多脱氧核糖核苷酸链，A
‑
T、G
‑
C间以氢键形成碱基配对(base pair,bp)，形成稳定的双股螺旋结构。
[0003]多核苷酸(Polynucleotides,PN)或多脱氧核糖核苷酸(Polydeoxyribonucleotides,PDRN)是从大分子DNA降解后取得的小片段产物，长度介于数十到数千碱基对，功能性PN/PDRN的长度介于50到2000碱基对；目前已知PN/PDRN的长度决定其生物功能性，对序列则没有特定要求。
[0004]以往研究显示PN/PDRN具有许多的生物活性，包括：促进细胞生长、提高细胞活性、促进DNA修复、抗发炎、抗氧化、促进血管生成、促进胶原蛋白合成、促进多种组织修复再生、促进伤口愈合、减少疤痕生成、减少皱纹、增加皮肤与弹性、减小毛孔粗大、抑制黑色素生成等功效。PN/PDRN目前已运用于多种医药品、医疗器械、美容产品中，例如再生类药物、关节腔填补剂、皮下植入剂、水光类美容产品、涂抹类美容产品。
[0005]既有PN/PDRN主要提取自人类或哺乳类动物的胎盘组织、大西洋鲑鱼的精细胞/精囊组织、虹鳟鱼的精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼的精细胞/精囊组织、中华鲟的精细胞/精囊组织。现有关于PN/PDRN的制备专利主要集中在如何从鱼类的精液和/或精囊中提取出多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸片段，包括：CN107287186A从鱼类的精液分离多脱氧核糖核苷酸的方法、CN110747194A一种小分子多聚脱氧核糖核苷酸及其制备与应用、CN112315836A一种高效的外用PDRN的制备方法及其应用。
[0006]专利技术人在实际使用过程中发现，这些现有技术至少存在以下技术问题：
[0007]1、现有制备方式的原料供应有限制：鱼类有一定的养殖周期，甚至要捕捞某些野生鱼种还有季节性问题，因此，现有技术制作PN/PDRN所需原料(raw material)的取得容易受到限制；
[0008]2、现有制备方式的PN/PDRN使用上有限制：人类或动物来源的材料在运用上常因病毒传播和不纯物的免疫原性等方面的安全风险问题而受到较严格的要求，因此，人类或动物来源PN/PDRN运用于在高侵入性医疗产品或医药品时易受限制，需要投入更多安全性
验证；
[0009]3、现有PN/PDRN产品的变异大：市售PN/PDRN产品不同批次取得PN/PDRN长度范围差异大，见图6(A)琼脂糖凝胶电泳图；由于PN/PDRN的长度范围与功能性相关，因此会可能造成功能性不稳定；另外、现有PN/PDRN常源自人类或鱼类，其基因体大小高达2x108～3x109碱基对，按23～32对染色体计算，平均每条染色体起始长度将近有3x106碱基对，要将其制作成50～2000碱基对大小范围的产品，转化效率难以掌控；
[0010]4、现有PN/PDRN潜在高风险：人类或鱼类来源的PN/PDRN，即使将片段大小控制在50～2000碱基对大小，PN/PDRN上的序列基本上完全无法掌握，无法完全排除因基因重组造成细胞癌变的可能，长期使用时存有潜在高风险；
[0011]5、现有PN/PDRN的成本偏高：现有制备方式使用的原料成本高，批次生产间PN/PDRN片段大小及转化效率均不易标准化，质量与成本皆难以管控，不利于规模化生产，因而使该原料无法广泛被运用。
技术实现思路
[0012]针对现有技术中存在的原物料取得困难、成本高、动物源污染风险、PN/PDRN片段大小控制不易等问题，本专利技术提出了一种固定长度重组PN/PDRN制备方法及其应用，其目的为：提供一种所需物料明确、制备时间短，同时能制备固定长度PN/PDRN的方法。
[0013]为实现上述目的本专利技术所采用的技术方案是：提供一种固定长度重组PN/PDRN制备方法，制备步骤如下：
[0014](1)建立PN/PDRN的DNA文库(DNAlibrary)
[0015](2)自步骤(1)DNA文库中选取固定长度的重组PN/PDRN；
[0016](3)将步骤(2)重组PN/PDRN作连结，得到多拷贝重组PN/PDRN；
[0017](4)将步骤(3)多拷贝重组PN/PDRN连结到克隆载体，得到多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
[0018](5)将步骤(4)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体引入适合细菌宿主，得到转化子；
[0019](6)将步骤(5)转化子进行培养，取得大量转化子；将转化子裂解并提取出多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；
[0020](7)将步骤(6)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体进行酶切和分离，以提取出固定长度重组PN/PDRN。
[0021]其进一步的优选技术方案为：步骤(1)中所述PN/PDRN，可以提取自包括但不限于人类细胞/组织、大西洋鲑鱼精细胞/精囊组织、虹鳟鱼精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼精细胞/精囊组织、中华鲟精细胞/精囊组织，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000个碱基对；PN/PDRN的DNA文库建立方式，可以使用包括但不限于自行设计制备、赛默飞MuSeek
TM
文库制备套组、赛默飞ClaSeek文库制备套组、赛默飞Invitrogen Collibri PCR
‑
Free PS文库制备套组或赛默飞Invitrogen Collibri PS DNA文库制备套组，更优选为自行设计制备，简述如下：
[0022](1)自制或选购市售PN/PDRN原料，取2mg PN/PDRN溶解于TE buffer溶液，先以T4 DNA聚合酶(T7 ligase)处理，将3
’‑
端突出序列切平，再加入脱氧核糖核苷三磷酸(Deoxyribonucleotide triphosphates,dNTPs)将5
’‑
端突出序列的互补位置补齐(fill
‑
in)，如此可使PN/PDRN片段末端平齐(blunt end)；
[002本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，制备步骤如下：(1)建立PN/PDRN的DNA文库(2)自步骤(1)DNA文库中选取固定长度重组PN/PDRN；(3)将步骤(2)固定长度重组PN/PDRN作连结，得到多拷贝重组PN/PDRN；(4)将步骤(3)多拷贝重组PN/PDRN连结到克隆载体，得到多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；(5)将步骤(4)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体引入适合细菌宿主，得到转化子；(6)将步骤(5)转化子进行培养，取得大量转化子；将转化子裂解并提取出多拷贝重组PN/PDRN克隆载体；(7)将步骤(6)多拷贝重组PN/PDRN克隆载体进行酶切和分离，以提取出固定长度的重组PN/PDRN。2.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述PN/PDRN，可以提取自包括但不限于人类细胞/组织、大西洋鲑鱼精细胞/精囊组织、虹鳟鱼精细胞/精囊组织、太平洋鲑鱼精细胞/精囊组织、中华鲟精细胞/精囊组织，长度介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000个碱基对；PN/PDRN的DNA文库建立方式，可以使用包括但不限于自行设计制备、赛默飞MuSeek文库制备套组、赛默飞ClaSeek文库制备套组、赛默飞Invitrogen Collibri PCR
‑
Free PS文库制备套组或赛默飞Invitrogen Collibri PSDNA文库制备套组，更优选为自行设计制备。3.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述固定长度PN/PDRN，固定长度是指介于30～5000个碱基对，更优选为50～2000碱基对；固定长度重组PN/PDRN可自步骤(1)DNA文库进行选殖或聚合酶链式反应扩增、或人工合成取得；PN/PDRN的序列不定，更优选为非编码区域的序列。4.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(3)中将固定长度重组PN/PDRN连结，可以使用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(3)中所述多拷贝重组PN/PDRN，包含2或多个拷贝固定长度的PN/PDRN片段。5.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(4)中将多拷贝PN/PDRN连结到克隆载体，可以选用包括但不限于T4 DNA连接酶、T3 DNA连接酶、T7 DNA连接酶进行连结，优选为T4 DNA连接酶；步骤(4)中所述克隆载体，包含但不限于pUC系列载体、pGEM系列载体、pBluescript系列载体、pTZ系列载体中的一种或多种，载体拷贝数>100，首选为拷贝数>300的载体。6.根据权利要求1所述的一种固定长度重组多核苷酸/多脱氧核糖核苷酸制备方法，其特征在于，步骤(5)中所述适...
【专利技术属性】
技术研发人员：周江鸿，李同琪，徐震梅，洪涛，李朔，
申请(专利权)人：尚诚怡美成都生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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