用于递送治疗剂的工程改造的Cry蛋白制造技术

本发明专利技术提供了新的重组蛋白，其能够自结晶并显示出所需的物理性质，例如增强的细胞摄取或和内涵体逃逸。还描述了编码所述重组蛋白的多核苷酸以及制备和使用这些蛋白质的方法。多核苷酸以及制备和使用这些蛋白质的方法。多核苷酸以及制备和使用这些蛋白质的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于递送治疗剂的工程改造的Cry蛋白
相关申请
[0001]本申请要求2019年4月16日提交的美国专利申请第62/834,605号的优先权，其内容通过引用整体并入本文用于所有目的。专利技术背景
[0002]在过去的几十年中，在分子和细胞水平上发现各种人类疾病的原因，结合基因工程和药物科学的技术进步，已经使得能够通过对患者施用治疗蛋白来治疗许多威胁生命的疾病。根据靶疾病以及治疗蛋白的性质和作用机制，治疗蛋白向靶组织或器官部位的递送在其特定途径，蛋白质稳定性或生物利用度以及因此其最终有效性方面显著不同，尽管已经进行了大量的工作致力于这样的研究努力。到目前为止，有效的递送仍然是通过施用治疗蛋白获得所需治疗结果的主要障碍。因此，迫切需要开发新的和改进的策略来递送用于医学治疗目的的治疗蛋白。本专利技术解决了这种和其它相关的需要。

技术实现思路

[0003]本专利技术提供了一种实现有效递送目的蛋白，例如治疗蛋白的新方法。因此，在第一方面，本专利技术提供了经修饰的Cry蛋白如多肽，其包含经修饰的SEQ ID NO:1中所示的氨基酸序列，所述经修饰的SEQ ID NO:1在SEQ ID NO:1的残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处的两个或更多个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个或更多个，或所有氨基酸被带电残基如赖氨酸或精氨酸替代，并且所述多肽在宿主细胞中表达后形成晶体。任选地，SEQ ID NO:1的残基533、535和536处的至少一个，两个或三个氨基酸被进一步修饰，例如被丙氨酸取代。另外，多肽可以包含与Cry3Aa(SEQ ID NO:1)具有类似结构的任何三结构域Cry蛋白，其在对应于Cry3Aa的结构域II的区域中的两个或更多个，三个，四个，五个，六个，七个，八个，九个，十个或更多个，或所有天冬氨酸和谷氨酸残基被赖氨酸或精氨酸替代，并且所述多肽在宿主细胞中表达后形成晶体。本专利技术通过以上文和本文所述的相同或相似的方式修饰其它Cry蛋白，提供了用于相同或相似用途的其它重组多肽。可经修饰(例如用赖氨酸或精氨酸取代)以实现类似电荷分布的其它Cry蛋白中的天冬氨酸和谷氨酸残基鉴定如下：Cry1Aa:SEQ ID NO:4中的残基308、332、379、384、387、409、412、418、460；Cry2Aa:SEQ ID NO:5中的残基379、383、385、396、420、436、437、451、479；Cry4Aa:SEQ ID NO:6中的残基392、408、430、436、444、455、457、468、483、495；Cry5B：SEQ ID NO：7中的残基375、389、397、402、425、430、433、437、473、490；Cry7Ca1:SEQ ID NO:8中的残基389、394、430、431、451、456、459、460、465、467、468、478、482；Cry8Ea1：SEQ ID NO：9中的403、430、435、449、455、457、459、461、465、468、473、489；Cry10Aa:SEQ ID NO:10中的残基396、410、413、419、422、426、435、446、453、465、466、477、486；和
Cry11A:SEQ ID NO:11中的残基381、422、443、455、457、460、469、473、484、487、498。
[0004]此外，本专利技术的多肽还包括通常对应于其结构域II的经修饰的Cry蛋白(例如经修饰的Cry3Aa蛋白)的片段，例如SEQ ID NO:2的389
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471片段，本专利技术人已经发现其为可溶性肽并且以类似于细胞穿透肽的方式起作用，并且因此具有有效转运其融合伴侣，即目的蛋白(例如，具有可检测标记例如荧光部分的蛋白，或生物活性蛋白，例如治疗蛋白)进入靶细胞的能力。
[0005]在一些实施方案中，本专利技术的多肽与异源部分连接。在一些情况下，该部分可以是肽，例如报道蛋白(其能够产生可检测的信号，例如，荧光团肽，例如mCherry)，或治疗蛋白(其能够在施用时赋予治疗效果)，或转录因子(其能够调节基因表达，例如，用于细胞重编程的OCT4)，或基因编辑蛋白(其能够识别和切割特定的DNA序列，例如，RNA引导的CRISPR
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相关(Cas)蛋白和Cre重组酶)，或酶(其能够识别和切割特定的肽序列或结构元件或合成底物，例如分选酶和胞嘧啶脱氨酶)，从而形成经修饰的Cry蛋白(例如，经修饰的SEQ ID NO:1，例如SEQ ID NO:2或其片段，例如，SEQ ID NO:2的389
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471区段)和所述肽的融合蛋白，尽管在其它情况下，异源部分可以是非肽部分，例如可检测标记(例如，包含放射性同位素，荧光染料或电子致密试剂的组合物)或固体基底/支持物。在一些实施方案中，多肽是包含修饰的SEQ ID NO:1和治疗蛋白的融合蛋白，其中SEQ ID NO:1的残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处的所有氨基酸已经被赖氨酸替代。在一些实施方案中，作为融合蛋白的多肽在SEQ ID NO:1中具有另外的修饰，例如，突变包括在一个，任选两个或全部三个残基533、535和536处的插入，缺失或取代。在一些实施方案中，融合蛋白包括经修饰的SEQ ID NO:1，其包含残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处的氨基酸已被赖氨酸替代，且残基533、535和536处的氨基酸已被丙氨酸替代，加上治疗蛋白，如p16蛋白或p53蛋白。在一些实施方案中，融合蛋白包括修饰的Cry蛋白的片段(例如，SEQ ID NO:2的389
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471区段)及其融合伴侣，即异源肽，其可以是能够产生可检测信号或所需生物活性的蛋白，如上文和本文中所例举的。
[0006]在第二方面，本专利技术提供了编码上述和本文所述的本专利技术多肽或融合蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列存在于表达盒中，所述表达盒通常是重组产生的核苷酸结构，其包含与编码多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子(例如，异源启动子)。在一些实施方案中，表达盒可以多核苷酸载体的形式存在，例如质粒或病毒载体。在相关方面，本专利技术提供了包含上述和本文所述多肽的宿主细胞，包含编码所述多肽的多核苷酸序列的宿主细胞，和包含含有编码所述多肽的多核苷酸序列的表达盒或载体的宿主细胞。在一些情况下，宿主细胞是细菌细胞或来源于细菌的细胞，特别是芽孢杆菌细菌的细胞，如枯草芽孢杆菌(Bs)或苏云金芽孢杆菌(Bt)细胞。在一些实施方案中，细菌是大肠杆菌。
[0007]在第三方面，本专利技术提供了重组产生本专利技术的多肽或融合蛋白的方法。所述方法包括以下步骤：(i)将上述和本文所述的编码本专利技术多肽的多核苷酸序列引入宿主细胞；和(ii)在允许表达所述多肽的条件下培养所述细胞。编码多肽的多核苷酸序列可以是表达盒或载体如质粒的形本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.多肽，其包含经修饰的SEQ ID NO:1，所述经修饰的SEQ ID NO:1在SEQ ID NO:1的残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处的两个或更多个，五个或更多个或全部氨基酸被赖氨酸替代，其中所述多肽在宿主细胞中表达后形成晶体。2.如权利要求1所述的多肽，其中SEQ ID NO:1的残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处的所有氨基酸已被赖氨酸替代。3.如权利要求2所述的多肽，其中所述经修饰的SEQ ID NO:1还包含残基533、535和536处的突变。4.如权利要求3所述的多肽，其中所述经修饰的SEQ ID NO:1包含在残基391、395、423、430、432、433、436、461、462、463和466处已被赖氨酸替代的氨基酸，和在残基533、535和536处已被丙氨酸替代的氨基酸。5.如权利要求1所述的多肽，其与异源部分连接。6.如权利要求5所述的多肽，其是融合蛋白，其中所述异源部分是报道蛋白或治疗蛋白。7.如权利要求6所述的多肽，其是包含所述经修饰的SEQ ID NO:1和治疗蛋白的融合蛋白。8.核酸，其包含编码权利要求1
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7中任一项所述的多肽的多核苷酸序列。9.表达盒，其包含与编码权利要求1
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7任一项所述的多肽的多核苷酸序列可操作地连接的启动子。10.载体，其包含权利要求9所述的表达盒。11.宿主细胞，其包含权利要求1
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7中任一项所述的多肽，权利要求8所述的核酸，或权利要求9所述的表达盒，或权利要求10所述的载体。12.如权利要求11所述的宿主细胞，其是细菌细胞。13.如权利要求12所述的宿主细胞，其是枯草芽孢杆菌(Bs)或苏云金芽孢杆菌(Bt)细胞或大肠杆菌细胞。14.产生权利要求1所述的多肽的方法，其包括以下步骤：(i)将权利要求8所述的核酸，或权利要求9所述的表达盒，或权利要求10所述的载体引入宿主细胞；和(ii)在允许表达融合蛋白的条件下培养细胞。15.如权利要求14所述的方法，其中所述宿主细胞是细菌细胞。16.如权利要求15所述的方法，其中所述宿主细胞是枯草芽孢杆菌(Bs)或苏云金芽孢杆菌(Bt)细胞或大肠杆菌细胞。17.如权利要求14所述的方法，其还包括纯化融合蛋白的步骤(iii)。18.组合物，其包含权利要求1所述的多肽和哺乳动物细胞。19.如权利要求18所述的组合物，其中所述多肽是结晶的。20.如权利要求18所述的组合物，其中所述哺乳动物细胞是癌细胞、上皮细胞、成纤维细胞、神经元细胞或免疫细胞。21.将治疗蛋白递送到哺乳动物细胞中的方法，其包括将权利要求1所述的多肽与哺乳动物细胞接触的步骤，其中所述多肽是经修饰的SEQ ID NO:1和...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈文博，李明名，杨藻锋，
申请(专利权)人：香港中文大学，
类型：发明
国别省市：