本发明专利技术公开了一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用。所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ No.2所示，含有510个氨基酸，理论分子量约55.911kd，构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白表达菌株能够有效稳定和大量地表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白。本发明专利技术的重组人源胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥，作为促进创面愈合材料具有起效时间短、创面愈合速度快的优点，适用于生物医用材料和化妆品领域。域。域。
【技术实现步骤摘要】
重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用
[0001]本专利技术属于生物工程
，涉及一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白((RHCⅠ))在制备促进创面愈合材料中的应用。
技术介绍
[0002]创面的修复愈合是一个复杂、动态的生物学过程。愈合包括了止血、炎症反应、肉芽组织再生以及基质重塑四个步骤。愈合过程顺利进行是确保皮肤修复以及功能恢复的重要前提，其中肉芽组织和上皮再生在创面愈合中的作用至关重要。
[0003]胶原蛋白(Collagen)是脊椎动物体内最重要的结构蛋白，约占蛋白总量的25～30％。作为细胞外基质中含量最丰富的蛋白，胶原蛋白是结缔组织和几乎所有薄壁器官间隙组织中最主要的结构蛋白，起着稳定组织和器官并维持其结构完整的作用。研究表明，胶原蛋白应用于创面具有强效的抗感染能力，能够促进细胞生长、黏附、止血和伤口愈合。作为细胞外基质(ECM)主要结构成分，胶原蛋白含量最多并且相互聚合、连接，并参与组织器官形态发生、代谢更新、损伤修复。胶原蛋白应用于创面可通过促进ECM内细胞募集以及纤维蛋白的合成等加速创面愈合，因此胶原蛋白的表达和分解直接影响创面愈合速度。正常皮肤组织中的胶原蛋白分为Ⅰ型和Ⅲ型胶原蛋白。Ⅰ型胶原蛋白主要分布于皮肤细胞外间质，具备引导上皮细胞迁入缺损区的功能，同时在细胞迁移过程中起到支持和润滑作用。另外，Ⅰ型胶原纤维相对粗大的特性，更决定了新生皮肤组织的抗拉性和创面愈合成熟程度。
[0004]目前，应用于创面修复的胶原蛋白主要来源于动物。但天然动物胶原蛋白分子量大小不等，性质非常复杂，存在的动物病毒隐患在应用过程中无法彻底消除。
技术实现思路
[0005]本专利技术的目的在于提供一种重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用。本专利技术将重组人源胶原蛋白应用于创面愈合修复，克服了动物胶原蛋白的缺陷，具有无病毒隐患、无免疫原性和良好的水溶性以及生物相容性的优点。
[0006]本专利技术所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用，所述的促进创面愈合材料可以是促进创面愈合的组合物，如与抑菌材料等复配制成促进创面愈合的药物组合物；或促进创面愈合的敷料等。
[0007]在本专利技术的具体实施方式中，所述的促进创面愈合材料中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.1％(w/v，g/mL)。本专利技术所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白，氨基酸序列如SEQ No.2所示。
[0008]本专利技术所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。
[0009]本专利技术构建的重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的核苷酸序列如SEQ No.4所示，通过将重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因Iα1 510aa双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I间构建而成。
[0010]本专利技术构建的分泌表达重组人源Ⅰ型胶原蛋白的菌株为巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201，保藏编号为CGMCC No.16461，该菌种已于2018年9月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。所述的巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris JY0201通过将Sac I酶切得到的线性化重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa诱导入巴斯德毕赤酵母中构建而成。
[0011]本专利技术从已知序列的人体胶原蛋白基因I型的螺旋区中选择水溶性、稳定性强的核苷酸序列，将优选基因片段插入毕赤酵母表达质粒中，转化毕赤酵母筛选得到高表达毕赤酵母基因工程菌，经过初步发酵及纯化步骤，得到高纯度的重组类人胶原蛋白。本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白具有良好的亲水性及稳定性，其结构与天然胶原蛋白基因序列相应部分100％相同，应用于人体当中不会造成免疫排斥。相同浓度下，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复能力更突出，孵育24h显示重组人源Ⅰ型胶原蛋白的细胞修复百分比分别比空白对照组和罗非鱼胶原蛋白组高出19.67％和15.69％，具有起效时间短、创面愈合速度快的优点，作为促进创面愈合材料适用于生物医用材料和化妆品领域。
附图说明
[0012]图1为人Ⅰ型α1链胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0013]图2为重组人源Ⅰ型胶原蛋白氨基酸的疏水性分析图。
[0014]图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。
[0015]图4为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的Sac I酶切琼脂糖凝胶电泳图。
[0016]图5为电转后的毕赤酵母GS115平板图。
[0017]图6为阳性克隆菌株的凝胶电泳图。
[0018]图7为阳性克隆菌株的PCR凝胶电泳图。
[0019]图8为#3，#5，#7，#8阳性克隆菌株培养48和72小时的样品的蛋白表达分析图。
[0020]图9为#7阳性克隆菌株的蛋白表达的SDS-PAGE电泳图。
[0021]图10为对照组、罗非鱼胶原组和重组人源Ⅰ型胶原蛋白的人工伤口尺寸曲线。
[0022]图11为对照组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
[0023]图12为罗非鱼胶原组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
[0024]图13为重组人源Ⅰ型胶原蛋白组0小时和24小时人工伤口的愈合程度图。
具体实施方式
[0025]下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。
[0026]实施例1
[0027]1.蛋白序列选择
[0028]对人Ⅰ型α1链胶原蛋白的氨基酸序列(SEQ No.1)进行疏水性分析，评价结果如图1所示。疏水性评价分值越低其亲水性越好。根据疏水性分析结果，选择评分低的氨基酸片
段，将这些片段整合成新的蛋白，即本专利技术的重组人源Ⅰ型胶原蛋白(SEQ No.2)。对重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸进行疏水性分析，结果如图2所示，该蛋白中所有氨基酸疏水性评价均低于零，表明该蛋白的亲水性很好。
[0029]2.质粒构建及线性化
[0030]将重组人源Ⅰ型胶原蛋白翻译成碱基序列(SEQ No.3)，采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因Iα1 510aa，双酶切连接至ppic9K载体的EcoR I和Not I之间，图3为重组人源Ⅰ型胶原蛋白质粒ppic9K-Iα1 510aa的构建示意图。将获得的重组质粒ppic9K-Iα1 510aa转入TOP10克隆菌株，挑取阳性克隆子测序，测序结果拼接如SEQ No.4所示。SEQ No.4的第77-82碱基处及1625-1632碱基处区域为酶切位点。
[0031]提取质粒20μg，使用Sac I酶切线性化，冻干浓缩待用。37℃消化3h本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.重组人源Ⅰ型胶原蛋白在制备促进创面愈合材料中的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的氨基酸序列如SEQ No.2所示。2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进创面愈合材料为促进创面愈合的组合物或促进创面愈合的敷料。3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的促进创面愈合材料中，重组人源Ⅰ型胶原蛋白的浓度为0.1％w/v。4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的重组人源Ⅰ型胶原蛋白的编码基因为Iα1 510aa，核苷酸序列如SEQ No.3所示。5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵健烽，朱逸丽，余继刚，高力虎，冯丽萍，黄建民，
申请(专利权)人：江苏江山聚源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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