一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其氨基酸序列结构如下所示，本发明专利技术基于组蛋白H3的氨基酸序列，以H3K27位点为中心进行设计，以保护的赖氨基酸为原料，经过非天然氨基酸和多肽的合成，实现了这种多肽探针的合成。本发明专利技术发现了与组蛋白H3K27位点乙酰化和巴豆酰化修饰的靶标蛋白STAT3。本发明专利技术能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，对于寻找组蛋白H3K27翻译后修饰Readers、Writers和Erasers等调控蛋白提供了一种新的思路。一种新的思路。一种新的思路。

【技术实现步骤摘要】
一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途


[0001]本专利技术属于生物化学领域，涉及一种多肽探针，具体来说是一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰修饰的多肽探针及其制备方法和用途。

技术介绍

[0002]近年来，随着表观遗传学的深入发展，DNA的甲基化乙酰化等修饰、RNA的甲基化乙酰化等修饰以及组蛋白的各类修饰被相继发现。越来越多的证据表明，组蛋白的翻译后修饰(PTM)在多种生物过程中起着关键作用，如细胞分化和器官发育，组蛋白的异常修饰可导致癌症等疾病。赖氨酸的翻译后修饰(PTM)是调节多种生物过程的重要组蛋白标记；然而，许多新发现的组蛋白赖氨酸PTM的功能作用和调节机制尚不清楚。
[0003]2011年芝加哥大学的赵英明研究团队发现赖氨酸巴豆酰化(Kcr)是种新的组蛋白标记类型，并且研究表明组蛋白赖氨酸巴豆酰化独特的结构和基因组定位说明它在机制和功能上不同于组蛋白赖氨酸乙酰化(Kac)。随后关于组蛋白赖氨酸巴豆酰化Reader、Writer和Eraser以及巴豆酰化修饰相关的调控机制研究逐渐兴起。
[0004]经过近十年的研究，组蛋白巴豆酰化修饰相关的调控机制和涉及到的蛋白还是非常有限；为了寻找和验证组蛋白赖氨酸巴豆酰化相关的蛋白，化学生物学家们也开发了各类方法来进行验证和探索。
[0005]2014年，香港大学李祥实验室开发了H3K4Cr多肽探针，通过光交联将赖氨酸巴豆酰化介导的非共价蛋白质
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蛋白质相互作用转化为不可逆的共价键，发现了SIRT3具有组蛋白巴豆酰化的消除活力。
[0006]2017年北京大学陈鹏课题组与香港大学李祥课题组合作设计了赖氨酸巴豆酰化修饰的光交联探针(K*cr)和带有保护基团的光交联探针(PNBK*)两个探针，将这两种探针分别引入到组蛋白H3的56位和79位，并通过光交联基团捕捉到了H3上79位巴豆酰化的去乙酰化酶Sirt3。
[0007]香港大学李祥实验室2021年6月设计了一种可光交联、可点击和可切割的三功能氨基酸ADdis
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Cys，与质谱(ADdis
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Cys
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MS)结合使用成功地识别了几个组蛋白H3K4甲基化和巴豆酰化的Readers。然而，目前报道的组蛋白翻译后修饰多肽探针都是在组蛋白多肽序列中上插入功能性共价交联基团，这改变了原本多肽的氨基酸序列，而且插入了较大的共价反应结构，这对于组蛋白多肽和靶标蛋白的识别和结合有负面影响。
[0008]组蛋白H3上丰富的赖氨酸残基以及各类PTM修饰对基因的表达，细胞分化和癌症的发生有密切的关系，近些年来，研究者对组蛋白H3赖氨酸PTM修饰相关的结合蛋白进行了多项研究，证明了组蛋白H3赖氨酸的PTM修饰对细胞的生长发育，基因的表达调控以及肿瘤的发生具有重要的作用。

技术实现思路

[0009]针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针及其制备方法和用途，所述的这种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，和目前的多肽探针相比具有结构精简，易合成的优势；不需要在序列中插入结构复杂并且对于组蛋白多肽和靶标蛋白的识别和结合有负面影响的共价反应基团，这对于抓取组蛋白H3K27位点翻译后修饰的互作蛋白以及探索新的靶标蛋白具有更大的优势。
[0010]本专利技术提供了一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其氨基酸序列结构如下所示，
[0011][0012]其中，R1为炔基、叠氮、荧光团或者生物素；R2为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；R3为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；Y为碳原子或者氧原子；m为1或者4。
[0013]进一步的，所述的Y为氧原子；m为4，非天然氨基酸替换赖氨酸，所述的非天然氨基酸的结构式为：
[0014]本专利技术还提供了上述基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针的制备方法，包括如下步骤：
[0015]1)将4
‑
(2
′
,4
′‑
二甲氧基苯基
‑
芴甲氧羰基
‑
氨甲基)
‑
苯氧基乙酰氨基
‑
甲基二苯甲胺(Rink Amide MBHA)树脂用二氯甲烷(DCM)溶胀；
[0016]2)用溶于N,N
‑
二甲基甲酰胺(DMF)体积百分比浓度为50％的吗啡啉脱去Fmoc保护基，之后分别用N,N
‑
二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤；
[0017]3)根据的结构式，从Fmoc保护的氨基酸5eq以起始树脂负载度计算，2
‑
(7
‑
氮杂苯并三氮唑)
‑
N,N,N',N'
‑
四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)5eq混合用N,N
‑
二甲基甲酰胺溶解充分，随后加入N,N
‑
二异丙基乙胺(DIPEA)10eq活化，加入树脂反应；反应结束之后分别用N,N
‑
二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤，相同的方法连接下一个氨基酸，直到接好一条完整的基于组蛋白H3K27的多肽骨架；
[0018]4)接下来按照氨基酸合成的方法连接氨基乙酸(Ahx)和基团R1，然后用钯单独脱去H3K27位点氨基酸的Alloc/Ally保护，最后连接R2和R3基团。
[0019]本专利技术还提供了一种非天然氨基酸的制备方法，其化学反应的方程式为：
[0020]以主链和侧链均为Boc保护的赖氨酸a作为起始原料，用叔丁醇给原料
[0021]a的羧基添加叔丁基保护，得到完全保护的赖氨酸b；然后通过水合氧化钌和高碘酸钠的催化，赖氨酸b侧链氨基临近的碳原子被氧化形成羰基，从而得到中间产物c；然后用硼氢化钠还原中间产物c，从而得到氨基酸侧链羟基替换氨基的中间产物d；然后用溴丙烯给中间产物d的侧链羟基添加烯丙基(Ally)保护，得到中间产物e；然后用三氟乙酸脱去主链氨基和羧基的保护基得到中间产物f；最后用芴甲氧羰酰琥珀酰亚胺(Fmoc
‑
OSu)给中间产物f的主链氨基添加Fmoc保护基，从而得到可直接用于多肽固相合成的终产物非天然氨基酸g。
[0022]上述反应的方程式如下所示：
[0023][0024]本专利技术还提供了上述的多肽探针在制备靶向和抓取识别组蛋白乙酰化和巴豆酰化修饰蛋白STAT3的药物中的用途。
[0025]本专利技术基于组蛋白H3的氨基酸序列，以H3K27位点为中心进行设计，以保护的赖氨基酸为原料，经过天然氨基酸和多肽的合成，实现了这种多肽探针的合成，并对其进行了初步的应用验证，发现了能与组蛋白H3K27位点乙酰化和巴豆酰化修饰相互作用的靶标蛋白STAT3。本专利技术能提高多肽探针与组蛋白赖氨酸翻译后修饰靶标蛋白的结合，对于寻找组蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其特征在于，其氨基酸序列结构如下所示，其中，R1为炔基、叠氮、荧光团或者生物素；R2为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；R3为氢、甲基、乙酰基、磺酰基、丙烯酰基或者巴豆酰基；Y为碳原子或者氧原子；m为1或者4。2.根据权利要求1所述的一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针，其特征在于，所述的Y为氧原子；m为4，采用非天然氨基酸替换赖氨酸，所述的非天然氨基酸的结构式为：3.权利要求1所述的一种基于组蛋白H3K27位点翻译后修饰的多肽探针的制备方法，包括如下步骤：1)将4
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(2
′
,4
′‑
二甲氧基苯基
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芴甲氧羰基
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氨甲基)
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苯氧基乙酰氨基
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甲基二苯甲胺树脂用二氯甲烷溶胀；2)用溶于N,N
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二甲基甲酰胺体积百分比浓度为50％的吗啡啉脱去Fmoc保护基，之后分别用N,N
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二甲基甲酰胺、二氯甲烷交叉洗涤；3)根据的结构式，从Fmoc保护的氨基酸5eq以起始树脂负载度计算，2
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(7
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氮杂苯并三氮唑)
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N,N,N',N'
‑

【专利技术属性】
技术研发人员：李子刚，尹丰，郭小春，王蕊，
申请(专利权)人：北京大学深圳研究生院，
类型：发明
国别省市：