一种荧光法耐药微生物的筛选方法技术

一种荧光法耐药微生物的筛选方法，包括：将微生物在含有抗生素以及叠氮或炔基基团的氨基酸的第一培养物中培养第一预定时间；将经所述第一培养物培养的所述微生物转移至含有炔基或叠氮基团的荧光染料的反应液中反应第二预定时间；对经过所述反应液培养的微生物进行荧光检测，且确定具有荧光信号的微生物为耐药微生物。本发明专利技术提供了一种快速检测耐药微生物的方法。物的方法。物的方法。

【技术实现步骤摘要】
一种荧光法耐药微生物的筛选方法


[0001]本专利技术涉及生化检测分析
，特别涉及一种耐药微生物的筛选方法。

技术介绍

[0002]抗菌药物如抗生素是人类历史上最伟大的专利技术之一，它有效控制了细菌感染，挽救了数以亿级的生命。在畜牧养殖业，抗菌药物的使用也大大提高了家畜的存活率，保障了农户的收益。然而抗菌药物尤其是抗生素的滥用和错用却大大提高了环境中细菌的耐药性，导致细菌感染无法有效治愈，目前已在世界范围内出现了对多种抗生素等药物的“超级细菌”，严重威胁了人类、动物和环境的健康，更为严重的是，耐药基因可以借助可移动遗传元件，如质粒、整合子、转座子、病毒等，通过接合、转化、转导等方式将耐药基因横向转移至其它菌株，使其它菌株产生耐药性，甚至促进多重耐药菌的产生和蔓延，加速了耐药性的传播。另外，环境中残留的各种抑菌和杀菌类抗菌药物，如抗生素、防腐剂、重金属，消毒副产物，甚至抗癌和抗抑郁药物，可通过共选择的途径促进耐药基因突变，诱导细菌产生耐药性。产生的耐药性还可进一步通过垂直转移在子代细菌中稳定遗传，导致具有耐药性的细菌不断增加。目前，耐药菌和耐药传播已成为全球最严峻的公共卫生问题，世界卫生组织提出了“遏制耐药
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今天不采取行动，明天就无药可用”的呼吁。因此，发展检测耐药菌和耐药传播和产生的方法，对于发展有效策略，积极遏制耐药产生和传播，保障全球的公共卫生和人类健康具有重大意义。然而，目前对耐药菌和耐药性传播和产生的检测，仍然缺乏快速、灵敏、精准和普适的方法。
[0003]现有技术用于检测和识别环境耐药菌的方法，主要是基于纯培养和分子检测技术。然而，纯培养方法只能用于检测可培养的微生物，而对于环境样品中绝大部分(＞99％)的不可培养微生物无计可施，且费时费力。分子检测技术则通过提取微生物总的基因组，然后检测抗性基因的有无或进行定量，该方法检测总的抗性基因包含死的耐药菌携带的抗性基因及不表达的抗性基因，因此造成耐药菌的大大高估。
[0004]因此，现有技术缺少一种能够快速进行耐药菌筛选的方法。

技术实现思路

[0005]针对上述方法存在的问题至少之一，本专利技术提供一种荧光法耐药微生物的筛选方法
[0006]包括：
[0007]一种荧光法耐药微生物的筛选方法，包括：
[0008]将微生物在含有抗生素以及叠氮和/或炔基基团的氨基酸，如HPG(L
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型高炔丙基甘氨酸)的第一培养物中培养第一预定时间；
[0009]将经所述第一培养物培养的所述微生物转移至含有炔基/叠氮基团的荧光染料，如FAM(羧基荧光素)叠氮荧光染料的反应液中反应第二预定时间；
[0010]对经过所述反应液反应后的微生物进行荧光检测，且确定具有荧光信号的微生物
为耐药微生物。
[0011]根据本专利技术的实施例，HPG可被微生物，如大肠杆菌进行同化，同化后的细胞与FAM反应后即可被荧光检测装置检测获得荧光；基于此，对于敏感菌而言，其被抗生素抑制后无法同化HPG，而耐药菌则可以正常同化HPG，因此，通过荧光检测的有无即可进行耐药菌的筛选，简化了耐药菌的筛选过程。
[0012]可选的，所述将微生物在含有抗生素以及HPG的第一培养物中培养第一预定时间，包括：
[0013]第一培养物的配制，所述第一培养物包括不含甲硫氨酸的M9无机盐培养基；
[0014]将所述微生物转移至所述第一培养物中，并进行HPG标记。
[0015]根据本专利技术的实施例，不含甲硫氨酸的M9无机盐培养基能够最大限度的降低对微生物对HPG同化的影响，从而保证结果的准确。
[0016]可选的，所述将微生物在含有抗生素以及HPG的第一培养物中培养第一预定时间，还包括：
[0017]将所述微生物在所述M9无机盐培养基中进行预培养以获得代谢活性较高的高活性微生物，采用所述高活性微生物进行HPG标记实验。
[0018]根据本专利技术的实施例，为了保证检测结果的可靠性，本专利技术通过设置预培养的方式进行代谢活性较高的高活性微生物筛选，并采用高活性微生物用于后续实验步骤，从而能够保证细胞对HPG的摄入量，保证后续荧光检测的有效性。
[0019]可选的，所述HPG标记实验，包括：
[0020]将所述高活性微生物转接至新鲜的所述M9无机盐培养基中，并在所述高活性微生物的不同生长周期添加HPG进行标记，和/或，在所述高活性微生物的同一生长周期添加HPG进行不同时长的标记，对经标记后的所述高活性微生物进行荧光检测，确定荧光信号最强的条件为最佳标记条件；
[0021]所述将所述微生物转移至所述第一培养物中，并进行HPG标记，包括，在所述最佳标记条件下进行所述HPG标记。
[0022]根据本专利技术的实施例，通过对最佳条件的摸索，能够保证HPG能够被细胞最大限度的同化，从而能够保证后续荧光检测过程的有效性。
[0023]可选的，所述将微生物在含有抗生素以及HPG的第一培养物中培养第一预定时间，还包括：
[0024]所述抗生素的浓度由所述微生物的种类确定，且所述抗生素的添加时间早于所述HPG的添加时间。
[0025]可选的，所述炔基和/或叠氮基团包括FAM，所述将经所述第一培养物培养的所述微生物转移至含有炔基和/或叠氮基团的荧光染料的反应液中反应第二预定时间，包括：
[0026]细胞固定过程，所述细胞固定过程包括将所述微生物置于固定液中用于提高所述微生物细胞膜通透性。
[0027]可选的，所述固定液的配置方法包括：
[0028]称取3g优级纯BSA(牛血清蛋白)，添加100mL的PBS(磷酸盐缓冲液)溶液溶解以形成第一混合液；
[0029]用移液枪吸取500μL的TritonX
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100，转移至所述第一混合液中混匀以形成第二混
合液；
[0030]称取4g多聚甲醛，加入100mL的所述第一混合液溶液，在60℃加热3h溶解后制得。
[0031]可选的，将经所述第一培养物培养的所述微生物转移至含有炔基和/或叠氮基团的荧光染料的反应液中反应第二预定时间，还包括：
[0032]将所述微生物转移至所述反应液中，经避光培养第二预定时间后，将所述反应液离心，并用缓冲液冲洗后形成供荧光检测的所述微生物。
[0033]可选的，所述荧光检测包括流式细胞仪检测和/或荧光显微镜检测。
[0034]可选的，所述微生物包括野生型大肠杆菌25922及抗生素耐药大肠杆菌，所述抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素、及四环素中的一种或多种。
[0035]本专利技术相对于现有技术至少有如下有益效果：
[0036]1.利用抗生素作用下，耐药细胞对HPG的同化作用，同化后的细胞与FAM进行反应，对反应后的细胞荧光检测的有无即可进行耐药菌的筛选，大大简化了耐药菌的筛选过程并且获得细胞的表型耐药。
[0037]2.采用不含甲硫氨酸的M9无机盐培养基进行细胞培养，这能够最大限度的降低培养基因素本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种荧光法耐药微生物的筛选方法，其特征在于，包括：将微生物在含有抗生素以及叠氮和/或炔基基团的氨基酸的第一培养物中培养第一预定时间；将经所述第一培养物培养的所述微生物转移至含有炔基和/或叠氮基团的荧光染料的反应液中反应第二预定时间；对经过所述反应后获得的微生物进行荧光检测，且确定具有荧光信号的微生物为耐药微生物。2.根据权利要求1所述的荧光法耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述叠氮和/或炔基基团的氨基酸包括HPG，所述将微生物在含有抗生素以及叠氮和/或炔基基团的氨基酸的第一培养物中培养第一预定时间，包括：第一培养物的配制，所述第一培养物包括不含甲硫氨酸的M9无机盐培养基；将所述微生物转移至所述第一培养物中，并进行HPG标记。3.根据权利要求2所述的荧光法耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述将微生物在含有抗生素以及HPG的第一培养物中培养第一预定时间，还包括：将所述微生物在所述M9无机盐培养基中进行预培养以获得代谢活性较高的高活性微生物，采用所述高活性微生物进行HPG标记实验。4.根据权利要求3所述的荧光法耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所述HPG标记实验，包括：将所述高活性微生物转接至新鲜的所述M9无机盐培养基中，并在所述高活性微生物的不同生长周期添加HPG进行标记，和/或，在所述高活性微生物的同一生长周期添加HPG进行不同时长的标记，对经标记后的所述高活性微生物进行荧光检测，确定荧光信号最强的条件为最佳标记条件；所述将所述微生物转移至所述第一培养物中，并进行HPG标记，包括，在所述最佳标记条件下进行所述HPG标记。5.根据权利要求4所述的荧光法耐药微生物的筛选方法，其特征在于：所...

【专利技术属性】
技术研发人员：林文芳，崔丽，杨凯，朱永官，
申请(专利权)人：中国科学院城市环境研究所，
类型：发明
国别省市：