KRT10定点基因敲入P2A-CrePR1-T2A-tdTomato小鼠模型的构建及应用制造技术

本发明专利技术公开了KRT10定点基因敲入P2A

【技术实现步骤摘要】
KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato小鼠模型的构建及应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，特别涉及一种KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato小鼠模型的构建及应用。

技术介绍

[0002]表达KRT10(角蛋白10)的Krt10
+
细胞位于皮肤的棘层，由基底层分化而来，属于分化的角质细胞。Krt10
+
细胞在维持细胞分化、保持皮肤屏障等功能方面发挥了重要作用。目前，尚未有研究报道关于Krt10
+
细胞的其他作用。并且，对于Krt10
+
细胞在其损伤修复、逆分化过程中发挥的作用知之甚少。

技术实现思路

[0003]本专利技术目的在于提供KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato小鼠模型的构建及应用，以解决现有技术中所存在的一个或多个技术问题，提供至少一种有益的选择或创造条件。
[0004]本专利技术一方面提供了KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
[0005]通过合成或是合成后体外转录的方式获得sgRNA，构建Cas9/sgRNA质粒，所述sgRNA的核苷酸序列为：5
’‑
AGTCTCTTCATACGGGCCACTGG
‑3’
(SEQIDNO.1)；
[0006]构建KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的重组打靶载体；
[0007]将所述Cas9/sgRNA质粒和所述重组打靶载体通过显微注射的方式注射到供体小鼠的受精卵中，得到转染受精卵；
[0008]将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，诞下F0代小鼠，对所述F0代小鼠进行基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；
[0009]将所述嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，后代经基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；
[0010]鉴定所述F1代小鼠，正确重组且没有随机插入的即为在KRT10基因启动子后面定点敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的小鼠，得到所述小鼠模型。
[0011]进一步，所述P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的核苷酸序列如SEQIDNO.2所示。
[0012]进一步，所述重组打靶载体是通过同源重组的方式在KRT10基因终止密码子位点定点敲入所述P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato得到Krt10
‑
P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato表达框。
[0013]进一步，所述重组打靶载体包含长度约为2kb的5
’
同源臂、P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato和长度约为2kb的3
’
同源臂。
[0014]进一步，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠。
[0015]进一步，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。
[0016]进一步，采用PCR鉴定方法对所述F0代小鼠进行基因型鉴定；F0代小鼠鉴定方法包
括以下引物：
[0017]EGE
‑
STY
‑
061
‑
L
‑
GT
‑
F：5
’‑
GCAGAAAAGAATCGCAAGGATGCTG
‑3’
(SEQIDNO.3)；
[0018]EGE
‑
STY
‑
061
‑
L
‑
GT
‑
R：5
’‑
AAACGCTGTGAGCTCGACACAACTC
‑3’
(SEQIDNO.4)；
[0019]EGE
‑
STY
‑
061
‑
R
‑
GT
‑
F：5
’‑
GTGGCAGATCCCACAGGAGTTTGTC
‑3’
(SEQIDNO.5)；
[0020]EGE
‑
STY
‑
061
‑
R
‑
GT
‑
R：5
’‑
AGGGTGGGGCTTACAACAATAGGTA
‑3’
(SEQIDNO.6)。
[0021]进一步，采用PCR鉴定方法对所述F1代小鼠进行基因型鉴定；F1代小鼠鉴定方法包括以下引物：
[0022]EGE
‑
STY
‑
061
‑
L
‑
GT
‑
F：5
’‑
GCAGAAAAGAATCGCAAGGATGCTG
‑3’
(SEQIDNO.3)；
[0023]EGE
‑
STY
‑
061
‑
L
‑
GT
‑
R：5
’‑
AAACGCTGTGAGCTCGACACAACTC
‑3’
(SEQIDNO.4)；
[0024]EGE
‑
STY
‑
061
‑
R
‑
GT
‑
F：5
’‑
GTGGCAGATCCCACAGGAGTTTGTC
‑3’
(SEQIDNO.5)；
[0025]EGE
‑
STY
‑
061
‑
R
‑
GT
‑
R：5
’‑
AGGGTGGGGCTTACAACAATAGGTA
‑3’
(SEQIDNO.6)；
[0026]EGE
‑
STY
‑
061
‑
WT
‑
F：5
’‑
GCTGAAACTAGCTGGGGTAATCTGAA...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：获取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的sgRNA，构建Cas9/sgRNA质粒；构建KRT10定点基因敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的重组打靶载体；将所述Cas9/sgRNA质粒和所述重组打靶载体注射到供体小鼠的受精卵中，得到转染受精卵；将所述转染受精卵移植到假孕母鼠的子宫中，诞下F0代小鼠，对所述F0代小鼠进行基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为嵌合体小鼠；将所述嵌合体小鼠与野生型小鼠杂交，后代经基因型鉴定，同源重组呈现阳性的小鼠即为F1代小鼠；鉴定所述F1代小鼠，正确重组且没有随机插入即为在KRT10基因启动子后面定点敲入P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的小鼠，得到所述小鼠模型。2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体是通过同源重组的方式在KRT10基因终止密码子位点定点敲入所述P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato得到Krt10
‑
P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato表达框。4.根据权利要求1至3任一项所述的构建方法，其特征在于，所述重组打靶载体包含长度约为2kb的5
’
同源臂、P2A
‑
CrePR1
‑
T2A
‑
tdTomato和长度约为2kb的3
’
同源臂。5.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述供体小鼠为C57BL/6J小鼠；优选地，所述假孕母鼠为C57BL/6J小鼠。6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用PCR鉴定方法对所述F0代小鼠进行基因型鉴定；F0代小鼠鉴定方法包括以下引物：核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示的EGE
‑...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈晓东，陈瑜，王旭升，何佳，王婧薷，杨荣华，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：