基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε-聚赖氨酸的生产方法和应用技术

本发明专利技术涉及一种基因工程高产ε

【技术实现步骤摘要】
Streptomyces albulus using pH shock strategy in the level of transcriptomics)一文中，利用转录组学分析，敲除了信号转导系统中的有关基因，说明了其对ε
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聚赖氨酸的产量存在着重要的作用。
[0009]如上所述，目前虽然有报道将基因工程技术用于菌株的改造上，但对于通过基因敲除构建工程菌提高ε
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聚赖氨酸产量的报道较少。因此，需要一种基于抑制支路代谢途径的策略，利用基因敲除手段改造ε
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聚赖氨酸产生菌以提高ε
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聚赖氨酸产量的方法，而不单单局限于对代谢途径中关键基因的过表达。
[0010]通过对比，本专利技术专利申请与上述公开文献存在本质的不同。

技术实现思路

[0011]本专利技术目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种基因工程高产菌株淀粉酶产色链霉菌及ε
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聚赖氨酸的生产方法和应用。
[0012]本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0013]一种淀粉酶产色链霉菌，名称为：6#
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7，分类命名为：淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0014]一种基因工程高产ε
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>聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，所述淀粉酶产色链霉菌通过将脂肪酸合成代谢通路中的关键基因脂肪酸ACP合酶基因fabF在Streptomyces diastatochromogenes6#
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7中分别敲除得到的。
[0015]进一步地，所述Streptomyces diastatochromogenes6#
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7的名称为6#
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7，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；敲除的基因序列分别为fabF1、fabF2、fabF3，基因碱基序列与SEQ No.32、No.33、No.34相似性达90％以上。
[0016]如上所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，步骤如下：
[0017](1)提取原始S.diastatochromogenes 6#
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7的基因组；
[0018](2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增目的基因上下游同源片段；
[0019](3)利用SOE
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PCR，将步骤(2)得到的上下游同源片段与用于替换目的基因的抗性片段连接，得到用于敲除目的基因的敲除组件；
[0020](4)将纯化后的融合片段即敲除组件和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，得到携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒；
[0021](5)将步骤(4)构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移法将所述的表达载体整合入S.diastatochromogenes6#
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7的基因组中，获得基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。
[0022]进一步地，所述步骤(3)中抗性为安普霉素抗性。
[0023]进一步地，所述步骤(4)中携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒的具体构建步骤如下：
[0024](1)敲除组件的获得：敲除组件包含fabF基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性即安普霉素抗性片段作为筛选标记；
[0025]以S.diastatochromogenes6#
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7的基因组为模板，根据fabF基因分别设计上下游同源片段引物序列fabF
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F/fabF
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R；以pSET152质粒为模板，根据安普霉素Apr抗性基因设计引物序列apr
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F/apr
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R；
[0026]在敲除组件上下游两端分别添加8个核苷酸，形成限制性内切酶EcoR I的酶切位点；
[0027](2)重组质粒的构建：将纯化后的融合片段和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNA ligase作用下与融合片段进行过夜连接，连接产物通过化学转化的方法转入到E.coli DH5α感受态筛选转化子，保存。
[0028]进一步地，所述步骤(4)中pJTU 412质粒不仅包含来源于大肠杆菌质粒的复制起始位ori COlEI点，也包含来源于链霉菌质粒的复制起始位点oripIJ101，因此该质粒可以在大肠杆菌和链霉菌中能够进行自主复制。
[0029]如上所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌在ε
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聚赖氨酸制备方面中的应用。
[0030]利用如上所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌发酵生产ε
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聚赖氨酸的方法，步骤如下：
[0031]将基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌接种在贝纳特培养基平板上，在28
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37℃培养直至产生孢子；然后，将孢子接种至M3G培养基摇瓶中，在28
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37℃，150
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200r/min，培养24
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30h，将培养好的种子转接到M3G培养基中进行发酵直至72h，即得含ε
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聚赖氨酸发酵液。
[0032]进一步地，每1LM3G培养基的组成为：(NH4)2SO410g/L，KH2PO41.36g/L，K2HPO40.8g/L，酵母提取物5g/L，用氨水调节pH到7.2，加水定容至900mL，121℃单独灭菌20min；在使用M3G培养基时，每取90ml M3G，再加入10ml10
×
的葡萄糖母液；
[0033]10
×
的葡萄糖母液：每称取100g葡萄糖，加入2ml20g/LZnSO4·
7H2O和2ml250g/LMgSO4·
7H2O，用去离子水定容至200ml后115℃单独灭菌30min；
[0034]每1L贝纳特培养基的组成为：葡萄糖10g/L，蛋白胨2g/L，酵母浸粉1g/L，牛肉膏1g/L，琼脂15
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20g/L，NaOH调pH 7.7，加水补充至1L，121℃灭菌20min。
[0035]本专利技术取得本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：名称为：6#
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7，分类命名为：淀粉酶产色链霉菌Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。2.一种基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述淀粉酶产色链霉菌通过将脂肪酸合成代谢通路中的关键基因脂肪酸ACP合酶基因fabF在Streptomyces diastatochromogenes 6#
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7中分别敲除得到的。3.根据权利要求1所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌，其特征在于：所述Streptomyces diastatochromogenes 6#
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7的名称为6#
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7，分类名称为Streptomyces diastatochromogenes，保藏编号为：CGMCC No.22261，保藏日期：2021年4月30日，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；敲除的基因序列分别为fabF1、fabF2、fabF3，基因碱基序列与SEQ No.32、No.33、No.34相似性达90％以上。4.如权利要求2或3任一项所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：步骤如下：(1)提取原始S.diastatochromogenes 6#
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7的基因组；(2)以步骤(1)提取得到的基因组为模板，采用PCR技术扩增目的基因上下游同源片段；(3)利用SOE
‑
PCR，将步骤(2)得到的上下游同源片段与用于替换目的基因的抗性片段连接，得到用于敲除目的基因的敲除组件；(4)将纯化后的融合片段即敲除组件和出发载体pJTU 412分别进行EcoR I单酶切，16℃条件下，在T4 DNAligase作用下与融合片段进行过夜连接，得到携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒；(5)将步骤(4)构建得到的重组质粒转化至大肠杆菌ET12567/pUZ8002中，通过接合转移法将所述的表达载体整合入S.diastatochromogenes6#
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7的基因组中，获得基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌。5.根据权利要求4所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中抗性为安普霉素抗性。6.根据权利要求4所述的基因工程高产ε
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聚赖氨酸菌株淀粉酶产色链霉菌的构建方法，其特征在于：所述步骤(4)中携带敲除目的基因的敲除组件的重组质粒的具体构建步骤如下：(1)敲除组件的获得：敲除组件包含fabF基因的等位位点，即该基因的上游同源片段及下游同源片段，以及用于替换目的基因的抗性即安普霉...

【专利技术属性】
技术研发人员：谭之磊，董天宇，贾士儒，侯颖，唐昆鹏，周东浩，闫佳佳，许倍铭，
申请(专利权)人：天津科技大学，
类型：发明
国别省市：