一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗制造技术

本发明专利技术提供了一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗，涉及生物医药技术领域。本发明专利技术利用NDV载体，新型冠状病毒S蛋白基因和S蛋白受体结合域RBD基因作为抗原序列，将S蛋白基因和RBD基因共同插入NDV基因组内，利用病毒反向遗传学技术，拯救获得具有限制感染性NDV病毒载体疫苗株。该疫苗株可以被呼吸道细胞识别，产生粘膜免疫，并感染细胞，引起特异性免疫抗体水平升高。本发明专利技术双抗原靶标的引入，增强了疫苗株免疫原性的发挥，同时降低了疫苗株毒副作用的产生，免疫效果相对于单靶标抗原更具优势。势。势。

【技术实现步骤摘要】
一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗


[0001]本专利技术属于生物医药
，具体涉及一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及相应疫苗株和疫苗。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒（SARS
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COV
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2）是一种新型β属冠状病毒，具有高传染性和高隐蔽性，可以通过多种途径，包括空气、食物等传播。新冠病毒的主要结构包括，单股正链核酸(ssRNA)、刺突蛋白(S)、膜蛋白(M)、包膜蛋白(E)和核壳蛋白(N)。其中，刺突S蛋白的RBD结构域是病毒识别宿主细胞膜受体蛋白ACE2蛋白的主要区域。S蛋白识别到细胞膜受体后，通过其S2结构域进入宿主细胞。所以，在研的新冠疫苗主要以S蛋白或者其RBD结构设计开发。
[0003]新城疫(Newcastle disease virus, NDV)病毒属于副粘病毒科Avulavirus属，是一种负链RNA病毒，其基因组包含N、P、M、F、HN和L六大基因以及非编码调控序列，以新城疫病毒为载体的重组病毒疫苗作为吸入或注射型疫苗的优秀候选，在人类中是安全的。但病毒承载外源基因有一定能力范围和插入位点要求，目前，以NDV为载体的新冠疫苗，主要是在病毒载体的P基因和M基因位置之间插入抗原S蛋白，但该技术手段产生的重组病毒载体疫苗株免疫原性十分有限，攻毒试验数据显示，其不能使免疫小鼠肺部的病毒载量下降超过2log，所以限制了NDV重组新冠病毒载体的推广及应用。如何在保证载体安全的前提下，提高NDV免疫原性以及抗体水平，成为亟待解决的问题。

技术实现思路

[0004]有鉴于此，本专利技术的目的在于提供一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体及疫苗株和疫苗，疫苗株可产生更强的免疫效果，可形成安全有效的新型冠状病毒载体疫苗，生产成本低。
[0005]为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体，所述双抗原靶标序列包括新型冠状病毒的S蛋白编码序列和S蛋白受体结合域RBD蛋白编码序列。
[0006]优选的，将所述新型冠状病毒的S蛋白编码序列插入新城疫病毒载体的P基因序列和M基因序列之间；将所述新型冠状病毒S蛋白受体结合域RBD蛋白编码序列插入新城疫病毒载体的P基因序列和M基因序列之间、M基因序列和F基因序列之间或HN基因序列和L基因序列之间。
[0007]优选的，所述S蛋白编码序列和RBD蛋白编码序列来源于相同或不同的新型冠状病毒流行株。
[0008]优选的，所述S蛋白编码序列包括完整的S蛋白编码序列或所述完整的S蛋白编码序列的变体。
[0009]优选的，所述变体包括对所述完整的S蛋白编码序列进行基因工程改造；所述基因工程改造的方法选自：突变、删除、重排和融合其他来源的蛋白多肽中一种或多种方法的组合；经所述基因工程改造后的S蛋白构象成为预融合状态更容易被抗原呈递细胞识别，或更多量地表达在细胞膜上，或经表达后分泌到细胞外并组合成易被抗原呈递细胞识别的多聚体。
[0010]优选的，所述突变包括将完整的S蛋白的K986和V987位氨基酸均突变为P，或将第682~685位氨基酸RRAR突变为GSAS，或将完整的S蛋白的K986、V987、F817、 A892、A899和A942位氨基酸均突变为P；或将S蛋白的C末端KLHYT突变为ALAYT；所述删除包括在所述完整的S蛋白的C末端截短18 ~28个氨基酸；或删除S蛋白的跨膜区和胞内区序列；所述重排包括将S蛋白的主要抗原决定序列S1蛋白的NTD和RBD区域位置序列进行调换，形成RBD
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NTD蛋白；所述融合其他来源的蛋白多肽包括将S蛋白的胞外域与新城疫F蛋白的C端包含跨膜区和胞内区的氨基酸序列融合；或将RBD
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NTD蛋白N端添加信号肽序列，C端添加融合蛋白多肽序列。
[0011]优选的，所述重排形成的RBD
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NTD蛋白，RBD和NTD区域通过蛋白Linker连接。
[0012]优选的，所述RBD蛋白编码序列还包括经过基因工程改造的含有RBD蛋白编码序列的RBD系列重组蛋白编码序列。
[0013]优选的，所述基因工程改造包括：在RBD蛋白编码序列的N末端添加分泌信号肽序列，C末端添加融合蛋白多肽序列。
[0014]本专利技术还提供了一种利用上述重组新城疫病毒载体制备得到的疫苗株。
[0015]优选的，所述制备的方法包括病毒反向遗传学的方法。
[0016]优选的，所述疫苗株的结构包括：上述重组新城疫病毒载体的编码序列和/或展示在重组新城疫病毒粒子表面的S蛋白或所述S蛋白的变体；所述S蛋白的变体由完整的S蛋白编码序列的变体编码得到。
[0017]本专利技术还提供了上述疫苗株在制备预防新型冠状病毒传播和感染疫苗中的应用。
[0018]本专利技术还提供了一种预防新型冠状病毒传播和感染疫苗的疫苗，所述疫苗包括上述疫苗株。
[0019]有益效果：一种利用新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）载体，新型冠状病毒S蛋白基因和S蛋白受体结合域RBD蛋白基因作为抗原靶标序列，将S蛋白基因和RBD蛋白基因共同插入NDV基因组之间，利用病毒反向遗传学技术，拯救获得具有限制感染性NDV疫苗株，该疫苗株可以被呼吸道细胞识别，产生粘膜免疫，并感染细胞，引起特异性免疫抗体水平升高。相对于目前在研的单个新冠S蛋白抗原或RBD蛋白抗原疫苗，本专利技术引入双抗原靶标，并对双抗原靶标编码序列分别进行了基因工程优化，双抗原靶标的引入，增强了疫苗株免疫原性的发挥，同时降低了疫苗株毒副作用的产生，免疫效果相对于单靶标抗原更具优势。
附图说明
[0020]图1为构建得到的新型冠状病毒S蛋白和RBD蛋白双抗原靶标重组NDV载体示意图；其中a表示S蛋白及其变体和RBD系列重组蛋白基因同时位于NDV病毒载体P
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M基因位置之间，通过2A肽序列连接；b表示S蛋白及其变体基因位于NDV病毒载体P
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M基因位置之间，RBD系列重组蛋白基因位于NDV病毒载体M
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F基因位置之间；图2为重组NDV病毒载体PCR鉴定电泳图，Marker由上到下大小依次为5000 bp、3000 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp、750 bp、500 bp、250 bp、100 bp，Lane1: NDV
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VH
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RBD
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Fc，Lane2: NDV
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S2P，Lane3: NDV
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S2P
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VH
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RBD
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Fc，Lane4: NDV
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S2P
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HSA
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RBD
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Folden，Lan本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种包含新型冠状病毒双抗原靶标序列组合的重组新城疫病毒载体，所述双抗原靶标序列组合包括新型冠状病毒的S蛋白编码序列和S蛋白受体结合域RBD蛋白编码序列。2.根据权利要求1所述重组新城疫病毒载体，其特征在于，将所述新型冠状病毒的S蛋白编码序列插入新城疫病毒载体的P基因序列和M基因序列之间；将所述新型冠状病毒S蛋白受体结合域RBD蛋白编码序列插入新城疫病毒载体的P基因序列和M基因序列之间、M基因序列和F基因序列之间或HN基因序列和L基因序列之间。3.根据权利要求1或2所述重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述S蛋白编码序列和RBD蛋白编码序列来源于相同或不同的新型冠状病毒流行株。4.根据权利要求3所述重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述S蛋白编码序列包括完整的S蛋白编码序列或所述完整的S蛋白编码序列的变体。5.根据权利要求4所述重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述变体包括对所述完整的S蛋白编码序列进行基因工程改造；所述基因工程改造的方法选自：突变、删除、重排和融合其他来源的蛋白多肽中一种或多种方法的组合；经所述基因工程改造后的S蛋白构象成为预融合状态更容易被抗原呈递细胞识别，或更多量地表达在细胞膜上，或经表达后分泌到细胞外并组合成易被抗原呈递细胞识别的多聚体。6.根据权利要求5所述重组新城疫病毒载体，其特征在于，所述突变包括将完整的S蛋白的K986和V987位氨基酸均突变为P，或将第682~685位氨基酸RRAR突变为GSAS，或将完整的S蛋白的K986、V987、F817、 A892、A899和A942位氨基酸均突变为P；或将S蛋白的C末端KLHYT突变为ALAYT；所述删除包括在所述完整的S蛋白的C末端截短18 ~28个氨基酸;或...

【专利技术属性】
技术研发人员：宋家升，陈瑞婷，孙慧敏，毛水花，周孟云，
申请(专利权)人：浙江迪福润丝生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：