一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品的制备方法，所述的制备方法中包括融合基因的编辑，所述的融合基因的编辑中包括：(1)在参与融合的两个基因的预期断点附近各设计一条sgRNA；(2)设计一个重组AAV载体使两处断裂的DNA发生同源重组修复。本发明专利技术的FISH质控品通过基因编辑获得融合序列与预期完全一致的融合基因细胞系作为原料，具有可稳定重复生产、可确保质控品均匀性和一致性的优点，避免临床样本或购买天然携带融合基因的细胞系作为质控品的缺陷。的细胞系作为质控品的缺陷。的细胞系作为质控品的缺陷。

【技术实现步骤摘要】
一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品及其制备方法


[0001]本专利技术属于分子检测领域，具体涉及一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品及其制备方法。

技术介绍

[0002]肺癌在发病数量与死亡人数上，是当之无愧的“癌中之王”。其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)约占80％
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85％。
[0003]随着精准医学的发展，肿瘤的治疗已进入靶向治疗的时代，而分子病理检测是其基础。在原发性肺癌诊疗规范中，推荐对于
Ⅱ‑Ⅲ
A期NSCLC、N1/N2阳性的非鳞癌患者及小标本鳞癌患者进行肿瘤组织表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)突变。对于晚期NSCLC患者，应在诊断的同时常规进行肿瘤组织的EGFR基因突变、间变性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase，ALK)和ROS1融合基因检测，有条件者可进行Braf突变、c
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Met 14号外显子跳跃突变、Her
‑
2突变、Ret融合基因等检测和PD
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L1免疫组化检测。
[0004]对中国非小细胞肺癌患者来说，最有临床价值的靶点是EGFR、ALK和ROS1。NCCN、ESMO肺癌共识及中国晚期非小细胞肺癌分子靶向治疗专家共识均明确建议：NSCLC患者在接受治疗之前应先检测EGFR、ALK和ROS1基因，根据基因状态决定相应的治疗策略。/>[0005]因此，如何准确的诊断这些基因的突变就成为临床的当务之急。EGFR突变的检测可采用ARMS
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PCR法；ALK融合基因检测可采用IHC(免疫组织化学)、FISH(荧光原位杂交)或RT
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PCR的方法；ROS1融合基因的检测可采用RT
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PCR或FISH的方法。不过研究表明，用RT
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PCR方法检测融合临床样本的融合基因存在较高的假阴性率，主要原因是：RT
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PCR只能检测已知的融合类型，不能检测未知的融合伙伴基因；且从临床FFPE样本中提取的RNA质量较差，扩增失败率较高。因此，对于肺癌中ALK、ROS1融合基因的检测，推荐将FISH作为实验室检测的标准方法。
[0006]因此，对FISH检测融合基因的质控显得尤为重要。目前在FISH检测时，要么不使用质控品，要么使用已知的临床样本或购买天然携带融合基因的细胞系作为质控品。这就带来一些潜在问题：(1)若不使用质控品，无法确保结果准确性；(2)若使用临床样本作为质控品，样本来源于数量有限的人体组织，属于一次性材料，无法长期稳定的用于质控品生产；使用临床样本存在组织异质性和不可重复性，不能很好的确保质控品的均匀性和一致性，无法稳定的提供质控。(3)若购买天然携带融合基因的细胞系用于制备质控品，这类细胞系来源十分有限，多数融合基因没有天然携带的细胞系；且这类细胞系不是单克隆细胞，背景复杂，细胞间存在异质性，常出现多种不同的FISH杂交信号。

技术实现思路

[0007]为了解决上述问题，本专利技术将通过精确诱导基因融合方法获得的带有特定融合基因的细胞进行培养、收集、固定、石蜡包埋、切片，制备成FFPE蜡片，可作为融合基因的FISH
质控品。由于采用可无限扩繁的细胞作为原料，本专利技术的FISH质控品具有可稳定重复生产、可确保质控品均匀性和一致性的优点，避免临床样本作为质控品的缺陷。由于采用基因编辑获得带有特定融合基因的单克隆细胞，本专利技术的FISH质控品不受天然细胞系可及性的限制，细胞背景单一，不存在异质性，FISH杂交信号纯合、稳定。
[0008]带有特定融合基因的细胞通过本专利技术的精确诱导基因融合的方法获得。该方法使融合断点序列与天然融合事件或设计的融合事件的序列完全一致，由此获得与预期完全相符的带有特定融合基因的基因编辑细胞。
[0009]一方面，本专利技术提供了一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品的制备方法。
[0010]所述的制备方法中包括：融合基因的编辑。
[0011]所述的制备方法中包括以下步骤：
[0012](1)融合基因的编辑；
[0013](2)携带融合基因的细胞培养和收集；
[0014](3)中性福尔马林固定；
[0015](4)琼脂糖凝胶溶液固定成型；
[0016](5)脱水后石蜡包埋；
[0017](6)切片展片烤片。
[0018]所述的融合基因的编辑中包括：
[0019](1)在参与融合的两个基因的预期断点附近各设计一条sgRNA；
[0020](2)设计一个同源重组AAV载体使两处断裂的DNA发生同源重组修复。
[0021]所述的sgRNA在基因预期断点上游或下游的100bp以内的区域，所述的预期断点在外显子内部、外显子边界或内含子区域。
[0022]优选地，所述的sgRNA选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。
[0023]优选地，所述的两个基因为基因A和基因B，所述的同源重组AAV载体包含两个结构区：
[0024]Ⅰ区为同源左臂，起始于基因A预期断点上游的100
‑
1000bp区域，终止于基因A的预期断点；
[0025]Ⅱ区为同源右臂，起始于基因B的预期断点，包含其下游的100
‑
1000bp区域。
[0026]优选地，所述的同源重组AAV载体Ⅰ区选自：SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.21；所述的同源重组质粒Ⅱ区选自：SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.22。
[0027]优选地，所述的融合基因的编辑方法包括以下步骤：
[0028](1)相关sgRNA的设计，AAV载体的制备；
[0029](2)基因融合的编辑；
[0030](3)融合基因mRNA的检测。
[0031]进一步具体地，所述的步骤(2)包括：将两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合，采用电穿孔的方法转染细胞。电穿孔结束后，使用重组AAV感染细胞。
[0032]优选地，所述的两条sgRNA分别与Cas9蛋白混合比例为1：3(质量比)；重组AAV的感染复数(AAV病毒基因组拷贝数与细胞数量的比值)为100000。
[0033]优选地，所述的融合基因为融合基因COSF408，为EML4基因(ENST00000318522.10)第13内含子部分区域与ALK基因(ENST00000389048.8)第19内含子之间的融合；针对EML4基因的sgRNA1：SEQ ID NO.2；针对ALK基因sgRNA2：SEQ ID NO.3；同源重组AAV载体Ⅰ区的序列为SEQ ID NO.10；Ⅱ区的序列为SEQ ID NO.11。
[0034]优选地，所述的融合本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于肿瘤融合基因荧光原位杂交检测的质控品的制备方法，其特征在于，所述的制备方法中包括：融合基因的编辑；所述的融合基因的编辑中包括：(1)在参与融合的两个基因的预期断点附近各设计一条sgRNA；(2)设计一个重组AAV载体使两处断裂的DNA发生同源重组修复。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述的sgRNA在基因预期断点上游或下游的100bp以内的区域，所述的预期断点在外显子内部、外显子边界或内含子区域。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的sgRNA选自SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.13、SEQ ID NO.14。4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的两个基因为基因A和基因B，所述的重组AAV载体包含两个结构区：Ⅰ区为同源左臂，起始于基因A预期断点上游的100
‑
1000bp区域，终止于基因A的预期断点；Ⅱ区为同源右臂，起始于基因B的预期断点，包含其下游的100
‑
1000bp...

【专利技术属性】
技术研发人员：韦良慎，邱凯，史鹏燕，魏孝林，辜依琳，林欣欣，郑静贤，张秀芝，
申请(专利权)人：菁良基因科技深圳有限公司，
类型：发明
国别省市：