巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用制造技术

本发明专利技术提出了一种巨藻谷胱甘肽S

【技术实现步骤摘要】
巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用


[0001]本专利技术涉及藻类基因工程的
，特别是指一种巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用。

技术介绍

[0002]随着现代工农业的快速发展和矿产资源的发展，生态环境特别是水生环境中重金属的污染越来越严重。海水中适量的重金属元素不会对海洋生物产生有害的影响，有些重金属甚至可以作为藻类正常生长和代谢所必需的微量营养物质；但是，重金属含量过高时，会对藻类造成伤害，产生污染。
[0003]重金属对藻类的毒性已成为污染生态学的热点之一。例如：铜。铜在藻类代谢中具有双重作用；一方面，铜是一种微量营养素，例如：作为氧化酶(细胞色素氧化酶和氨基氧化酶)的重要组成部分；另一方面，铜还在电子传递链中，例如：合成质体青素；但是，铜对藻类也有高毒性。铜对藻类生长的这种二元性一直延伸到活性氧代谢，作为铜锌超氧化物歧化酶(CuZn
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SOD)的一部分，是活性氧清除系统的重要组成部分，同时也能够通过对光合作用的毒性作用来增加活性氧的产生来引起氧化应激。
[0004]目前，现有技术中用来避免重金属对藻类生长危害的方法主要是诱变育种和转基因育种，这种通过新品种的培育而提高藻类对重金属胁迫作用的方法存在工作量大、耗时长、操作复杂和成功率低的问题，从而很难从根本上解决重金属对藻类生长胁迫的问题。

技术实现思路

[0005]本专利技术的目的是提供一种巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，旨在解决现有技术中采用诱变育种和转基因育种技术来提高藻类对重金属胁迫作用的方法存在工作量大、耗时长、操作复杂和成功率低的问题。
[0006]为了解决上述技术问题，本专利技术的技术方案是这样实现的：
[0007]本专利技术的一种巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用。
[0008]谷胱甘肽S
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转移酶(GST，EC2.5.1.18)在所有生物体中都普遍存在，是由一个大基因家族编码的多功能蛋白。根据氨基酸序列相似性和基因结构，在植物GST中鉴定出phi、tau、theta、zeta、lambda、脱氢抗坏血酸还原酶(DHAR)和真核生物翻译延伸因子1B的γ
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亚基(EF1Bg)七种谷胱甘肽S
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转移酶基因。谷胱甘肽S
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转移酶是一个二期酶，能够催化还原型谷胱甘肽和金属离子之间螯合物的形成，还能够还原谷胱甘肽的硫原子与I相亲电基团的结合，从而降低细胞内有毒物质(如活性氧)，并加速外源性释放。本专利技术使含巨藻GST基因的聚球藻转基因植株在铜离子胁迫条件下的生物量(OD
750
值)较野生聚球藻植株有显著增加，本专利技术的聚球藻转基因植株在铜离子胁迫条件下叶绿素和类胡萝卜素含量较没有铜离子胁迫(即无胁迫)条件下聚球藻转基因植株的叶绿素和类胡萝卜素含量变化不明显；因此，本专利技术所得的聚球藻转基因植株对铜离子有更强的耐受性。本专利技术操作简单，容易实现，工作量小，效率高，从根本上解决了铜离子对聚球藻生长的胁迫问题。
[0009]作为一种优选的实施方案，所述巨藻GST基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。巨藻GST基因就是巨藻谷胱甘肽S
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转移酶基因，这种巨藻GST基因能够在聚球藻中高效表达，提高了聚球藻对铜离子胁迫的耐受能力。
[0010]作为一种优选的实施方案，所述巨藻GST基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。本专利技术的巨藻GST基因的核苷酸序列含有651bp核苷酸，该序列为GST基因的编码序列，该编码序列能够编码具有如序列表SEQ ID No 2所示的216个氨基酸组成的蛋白。
[0011]作为一种优选的实施方案，所述巨藻GST基因能够提高聚球藻对铜离子胁迫的耐受性。本专利技术使含巨藻GST基因的聚球藻转基因植株在铜离子胁迫条件下的生物量(OD
750
值)较野生聚球藻植株有显著增加，本专利技术的聚球藻转基因植株在铜离子胁迫条件下叶绿素和类胡萝卜素含量较没有铜离子胁迫条件下聚球藻转基因植株的叶绿素和类胡萝卜素含量变化不明显；因此，本专利技术所得的聚球藻转基因植株对铜离子有更强的耐受性。
[0012]作为一种优选的实施方案，本专利技术的一种巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用包括以下步骤：1)取巨藻，提取RNA，合成cDNA，PCR扩增，得巨藻GST基因；2)将巨藻GST基因与聚球藻蛋白表达载体连接，构建含有巨藻GST基因的聚球藻表达载体；3)将含有巨藻GST基因的聚球藻表达载体加入聚球藻中培养，得聚球藻转基因植株。
[0013]本专利技术将巨藻谷胱甘肽S
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转移酶(GST)基因转化到聚球藻中，使之能够在聚球藻中高效表达，提高了聚球藻对铜离子胁迫的耐受能力。
[0014]作为一种优选的实施方案，所述聚球藻蛋白表达载体为pSyn_6。pSyn_6是载体的名字，这种聚球藻蛋白表达载体是一种商品化的载体，来源广，取材方便，价廉易得。
[0015]作为一种优选的实施方案，所述大肠杆菌为E.coli DH5α。E.coli DH5α是一种常用的大肠杆菌，来源广，取材方便，价廉易得。
[0016]作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，PCR扩增时，所用引物为引物GST1
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F和引物GST1
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R，引物GST1
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F的核苷酸序列如SEQ ID No 3所示，引物GST1
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R的核苷酸序列如SEQ ID No 4所示。本专利技术根据巨藻转录组序列所得的GST基因序列，通过OMIGA软件筛选出GST基因序列中含有的酶切位点，再通过Primer5.0软件设计含有合适酶切位点的GST基因序列的特异性引物——引物GST1
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F和引物GST1
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R，引物GST1
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F和引物GST1
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R在设计完成之后由引物公司制作成品直接使用。
[0017]作为一种优选的实施方案，所述步骤1)中，PCR扩增时，扩增条件为：94℃预变性30s；98℃变性10s，62℃退火30s，72℃延伸1min，共扩增30个循环，72℃延伸2min。本专利技术有效控制了扩增条件，实现了巨藻GST基因的有效扩增。
[0018]作为一种优选的实施方案，所述步骤3)中，培养是在含10μg/mL壮观霉素的BG11液体培养基中培养。本专利技术先将培育至对数期的聚球藻在室温下离心收集、加入BG11液体培养基重悬、再次离心收集、加入BG11液体培养基重悬，然后，加入含有巨藻GST基因的聚球藻表达载体，静置，接着，将藻液涂布到BG11平板上，光照培养，最后，接种于BG11液体培养基中培养。这种培育方法简单，操作方便。
[0019]与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：本专利技术首先克隆了巨藻GST基因，然后，将巨藻GST基因转化到聚球藻中，构建了巨藻GST基因的聚球藻表达载体，最后本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用。2.根据权利要求1所述的巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，其特征在于：所述巨藻GST基因的核苷酸序列如SEQ ID No 1所示。3.根据权利要求1所述的巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，其特征在于：所述巨藻GST基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No 2所示。4.根据权利要求1所述的巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，其特征在于：所述巨藻GST基因能够提高聚球藻对铜离子胁迫的耐受性。5.根据权利要求1
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4中任意一项所述的巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，其特征在于，包括以下步骤：1)取巨藻，提取RNA，合成cDNA，PCR扩增，得巨藻GST基因；2)将巨藻GST基因与聚球藻蛋白表达载体连接，构建含有巨藻GST基因的聚球藻表达载体；3)将含有巨藻GST基因的聚球藻表达载体加入聚球藻中培养，得聚球藻转基因植株。6.根据权利要求5所述的巨藻GST基因在聚球藻对铜离子胁迫的耐受性中的应用，其特征在于：所述聚球...

【专利技术属性】
技术研发人员：梁成伟，顾梓鹏，任玉东，张晓雯，叶乃好，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院黄海水产研究所，
类型：发明
国别省市：