用于鉴定罗氏沼虾性别的引物组、试剂盒、鉴别方法以及应用技术

本申请公开了用于PCR扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组，包括如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对。该引物组能够有效扩增出特异性片段，根据这些片段能够有效鉴别罗氏沼虾的性别，甚至能够区分雄性、雌性和超雌性基因型，为其杂交育种和基因分型提供了帮助。其杂交育种和基因分型提供了帮助。其杂交育种和基因分型提供了帮助。

【技术实现步骤摘要】
用于鉴定罗氏沼虾性别的引物组、试剂盒、鉴别方法以及应用


[0001]本申请涉及罗氏沼虾性染色体分子学鉴定的
，尤其涉及用于鉴定罗氏沼虾性别的引物组、试剂盒、鉴别方法以及应用。

技术介绍

[0002]罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)是一种大型淡水虾，隶属于节肢动物门甲壳纲十足目长臂虾科沼虾属。其作为一种重要的经济虾类，广泛分布于南亚和东南亚以及西太平洋地区。其雌雄个体间存在着显著差异的生长和发育速率，性成熟后，雄性个体显著比雌性个体大，经济效应较高。培育全雄种群的罗氏沼虾，是提高产量的有效策略。且单性化养殖产量要高于常规的雌雄混养，因此利用单性化养殖可大幅度提高养殖经济效益。
[0003]在甲壳动物中，促雄腺是雄性特有的关键器官，在甲壳动物的雄性性腺发育和第二性征的发育中起着关键的作用(Sagi A,Dan C,Milner Y.Effect of androgenic gland ablation on morphotypic differentiation and sexual characteristics of male freshwater prawns,Macrobrachium rosenbergii[J].Gen.Comp.Endocrinol.1990,77(1):15
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22.)。切除或移植促雄腺可以控制性别分化方向，该方面已在罗氏沼虾性别分化的研究中有所报道。将雄性沼虾的促雄腺切除，可以得到雌性化的个体。此类个体可与正常的雄性个体交配，获得罗氏沼虾全雄群体(Aflalo ED,Hoang TTT,Nguyen VH,et al.A novel two
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step procedure for mass production of all
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male populations of the giant freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii[J].Aquaculture.2006,256(1):468
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478.)。
[0004]然而，在对罗氏沼虾杂交育种过程中，准确鉴定其性别具有十分重要的意义。然而罗氏沼虾作为十足目动物，其染色体数目较多，而且其性染色体小，分型困难。因此，建立有效扩增其性染色体DNA的方法尤为关键。

技术实现思路

[0005]有鉴于此，本申请的目的在于至少提供一种有效扩增罗氏沼虾性染色体DNA的方法，并且以此方法能够有效鉴别罗氏沼虾性别，以在其杂交育种和基因分型中得以应用。
[0006]第一方面，本申请实施例公开了用于PCR扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组，包括如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对。
[0007]在本申请实施例中，所述第一引物对的靶标序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二引物对的靶标序列如SEQ ID NO.8所示，所述第三引物对的靶标序列如SEQ ID NO.9所示。
[0008]第二方面，本申请实施例公开了一种鉴定罗氏沼虾性别的试剂盒，包含如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对。
[0009]第三方面，本申请实施例公开了一种罗氏沼虾的性别鉴定方法，包括以下步骤：
[0010]提取罗氏沼虾肌肉组织的基因组DNA；
[0011]PCR扩增所述基因组DNA，利用如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对进行PCR扩增得到扩增产物；
[0012]检测所述扩增产物，根据检测结果确定所述罗氏沼虾的性别。
[0013]在本申请实施例中，使用所述第一引物对扩增所述基因组DNA，对扩增产物进行电泳检测；若电泳条带包括一545bp的条带，则罗氏沼虾为雄性；若电泳条带包括一545bp的条带和一390bp的条带，则罗氏沼虾为雌性。
[0014]在本申请实施例中，使用所述第二引物对扩增所述基因组DNA，对扩增产物进行电泳检测；若电泳条带包括一119bp条带，则罗氏沼虾为雌性；若电泳条带未扩增出条带，则罗氏沼虾为雄性。
[0015]在本申请实施例中，使用所述第二引物对扩增所述基因组DNA，对扩增产物进行定量分析，相对表达量大的样本对应的罗氏沼虾为超雌性，相对表达量小的样本对应的罗氏沼虾为雌性，无表达量的样本对应的罗氏沼虾为雄性个体。
[0016]在本申请实施例中，使用所述第三引物对扩增所述基因组DNA，对扩增产物进行定量分析，相对表达量大的样本对应的罗氏沼虾为雄性，相对表达量小的样本对应的罗氏沼虾为雌性，无表达量的样本对应的罗氏沼虾为超雌性个体。
[0017]在本申请实施例中，所述PCR扩增的扩增体系包括：8.5μL Mix体系、各0.25μL 10μM的上下游引物，1μL100 ng/μL的基因组DNA作为模板；其中，所述Mix体系包含100mM KCL、20mM Tris
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CL、3mM MgCL2、0.4mM dNTP混合物、0.1U/μLTaq DNA聚合酶；
[0018]所述PCR扩增程序为，依次进行的95℃处理5min、95℃处理30s和60℃处理30s，共30个循环后，继续依次进行72℃处理30s和72℃处理10min。
[0019]第四方面，本申请实施例公开了第一方面所述的引物组、第二方面所述的试剂盒在鉴定罗氏沼虾性别、杂交育种或基因分型中的应用。
[0020]与现有技术相比，本申请至少具有以下有益效果：
[0021]本申请实施例提供了扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组以及方法，该引物组能够有效扩增出特异性片段，根据这些片段能够有效鉴别罗氏沼虾的性别，甚至能够区分雄性、雌性和超雌性基因型，为其杂交育种和基因分型提供了帮助。
附图说明
[0022]图1为本申请实施例提供的罗氏沼虾性腺组织HE染色图。
[0023]图2为本申请实施例提供的罗氏沼虾性腺组织提取DNA的电泳图，第一泳道为Marker，其他为来自不同罗氏沼虾个体的提取DNA样本。
[0024]图3为本申请实施例提供的第一引物对对罗氏沼虾雌雄个体的PCR扩增产物的电泳结果。
[0025]图4为本申请实施例提供的第二引物对对罗氏沼虾雌雄个体的PCR扩增产物的电泳结果。
[0026]图5为本申请实施例提供的(A)第二引物对扩增超雌虾、正常雌虾和雄虾DNA qPCR的定量结果和(B)第三引物对扩增超雌虾、正常雌虾和雄虾DNA qPCR的定量结果。
具体实施方式
[0027]为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.用于PCR扩增罗氏沼虾性染色体片段的引物组，包括如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对。2.根据权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述第一引物对的靶标序列如SEQ ID NO.7所示，所述第二引物对的靶标序列如SEQ ID NO.8所示，所述第三引物对的靶标序列如SEQ ID NO.9所示。3.一种鉴定罗氏沼虾性别的试剂盒，包含如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对。4.一种罗氏沼虾的性别鉴定方法，包括以下步骤：提取罗氏沼虾肌肉组织的基因组DNA；PCR扩增所述基因组DNA，利用如SEQ ID NO.1～2所示的第一引物对、如SEQ ID NO.3～4所示的第二引物对和如SEQ ID NO.5～6所示的第三引物对中的至少一对进行PCR扩增得到扩增产物；检测所述扩增产物，根据检测结果确定所述罗氏沼虾的性别。5.根据权利要求4所述的性别鉴定方法，其特征在于，使用所述第一引物对扩增所述基因组DNA，对扩增产物进行电泳检测；若电泳条带包括一545bp的条带，则罗氏沼虾为雄性；若电泳条带包括一545bp的条带和一390bp的条带，则罗氏沼虾为雌性。6.根据权利要求4所述的性别鉴定方法，其特征在于，使用所述第二引物对扩增...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘雪，邱高峰，马克异，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：