一种提高植物分枝能力的方法、序列及果苗木繁育方法技术

本发明专利技术属于植物基因工程技术领域，公开了一种提高植物分枝能力的方法、序列及果苗木繁育方法，所述提高植物分枝能力的方法具体包括：利用CBF

【技术实现步骤摘要】
一种提高植物分枝能力的方法、序列及果苗木繁育方法


[0001]本专利技术属于植物基因工程
，尤其涉及一种提高植物分枝能力的方法、序列及果苗木繁育方法。

技术介绍

[0002]植物分枝是影响植物株型形成的重要因素，并对植物生物学特征及农业生产有着重要影响。植物生长过程中，腋芽和顶芽是由芽原基发育而来的，顶芽是茎的发育初期便一次性完成的，主要与植株的主干发育有关，而腋芽是从叶腋中所生出的定芽，常见于种子植物中，主要是与植物的分枝有关，顶芽与腋芽的形成与发育共同调控植株地上部分的生长与植物构型的形成。在植物腋芽形成与分枝发育阶段也会受到许多因素的影响，茎尖会以顶端优势的方式抑制腋芽的形成，进而影响茎的分枝。植物会受到自身激素(生长素、独脚金内酯和细胞分裂素)调节、养分分配和环境因子的影响，被众多复杂信号所调节，以此来调控腋芽的生长并影响植物新的分枝的形成，保证植物正常的生命活动。
[0003]植物分枝是影响植物株型的关键因素，不仅对植物适应环境非常重要，也影响农作物和园艺作物的栽培方式和产量。尤其在果树领域，植物的分枝高度、分枝数目、分枝长度、分枝角度以及分布方式对于果树的早期树形形成、果树的栽培管理、果树产量意义重大。侧枝的发生源于腋生分生组织的萌发，腋芽萌发后可以保持原品种的优良性状，这无疑在苹果苗木繁育和良种推广方面起到了巨大作用。但侧枝形成的具体机制在很大程度上尚不清楚，其作用机理尚待研究。CBF转录因子是AP2/ERF家族中一类重要的转录因子。在植物的进化历程中，CBF转录因子的结构域具有高度保守的PKKRAGRKKFRETRHP氨基酸序列，且能够调控与分枝表型的有关的下游基因的表达，进而参与到植物的生命活动进程中。
[0004]通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：在苹果苗木繁育和良种推广方面培育果树新品种时间长，无法实现短时间内提高植物的产量与品质。
[0005]解决以上问题及缺陷的难度为：基因的构建步骤繁多，苹果农杆菌转化叶片侵染的成活率较低。
[0006]解决以上问题及缺陷的意义为：转基因植株转入之后驯化困难，应用于田间还需一定的时间。

技术实现思路

[0007]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种提高植物分枝能力的方法、序列及果苗木繁育方法。
[0008]本专利技术是这样实现的，一种提高植物分枝能力的方法，所述提高植物分枝能力的方法使用CBF
‑
L基因。
[0009]进一步，所述提高植物分枝能力的方法具体包括：
[0010]第一步，利用CBF
‑
L基因的上游引物和下游引物对CBF
‑
L基因进行单克隆扩增，得到扩增产物；
[0011]第二步，利用克隆所得基因进行超表达载体的构建；
[0012]第三步，将植物超表达载体转入至“GALA
‑
3”植株中。
[0013]进一步，所述第一步的CBF
‑
L基因的单克隆扩增具体包括：
[0014](1)PCR扩增CBF
‑
L基因：以上游引物F和下游引物R为引物对，用如下表1中的40微升体系对CBF
‑
L基因进行单克隆扩增，得到CBF
‑
L核苷酸双链；其中，CBF
‑
L基因的CDS序列SEQIDNO:1；上游引物F的核苷酸序列SE QIDNO:2；下游引物R的核苷酸序列SEQIDNO:3；
[0015](2)将PCR扩增得到的CBF
‑
L核苷酸双链用10微升体系进行连接PMD
‑
19
‑
T(Simple)载体，在16℃下过夜连接，得到连接产物；
[0016](3)连接产物转化感受态细胞：
[0017]将从
‑
80℃超低温冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于1.5mL无菌的的离心管中，加入10微升连接产物，吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入200微升的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，30min后将将超净工作台打开进行灭菌，在15min后，开始烧涂布器，一般烧2
‑
3分钟，放到超净工作台上等待至室温；摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10～12h，待长出菌斑；
[0018](4)挑斑：在无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个上述菌斑，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4
‑
6h，得到菌液；
[0019](5)菌液鉴定：摇菌结束后用10微升体系进行PCR鉴定，以上述菌液为模板，选用的上游引物为载体的序列，选用的下游引物为基因的下游引物，按照正常的菌批验证流程进行鉴定，以水为阴性对照；跑一个小孔胶，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。
[0020]进一步，所述第二步的构建植物超表达载体CBF
‑
L
‑
pBI121：
[0021](1)将阳性的菌液提质粒，得到连有CBF
‑
L的PMD
‑
19
‑
T(Simple)融合质粒；
[0022](2)将连有CBF
‑
L的PMD
‑
19
‑
T(Simple)融合质粒和PBI121空载体按照40微升体系进行双酶切，37℃反应2～6h以上，酶切3h；
[0023](3)目的基因与目的载体的回收和连接：酶切反应时间结束后，将上述切取目的基因的条带进行胶回收，同时将目的载体的酶切条带也切下进行胶回收，然后用10微升体系对目的基因与目的载体进行连接；
[0024](4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；然后，将大肠杆菌DH5α感受态细胞从
‑
80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取20微升的大肠杆菌DH5α感受态细胞于一个的1.5mL的无菌离心管中，吸取构建好的连接产物10微升，吹打混匀，冰浴30min，42℃热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入200微升的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，30min后将将超净工作台打开进行灭菌，在15min后，开始烧涂布器，烧2
‑
3分钟，放到超净工作台上等待变至室温，在摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10
‑
12h；
[0025](5)挑斑：无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种提高植物分枝能力的方法，其特征在于，所述提高植物分枝能力的方法使用CBF
‑
L基因。2.如权利要求1所述的提高植物分枝能力的方法，其特征在于，所述提高植物分枝能力的方法具体包括：第一步，利用CBF
‑
L基因的上游引物和下游引物对CBF
‑
L基因进行单克隆扩增，得到扩增产物；第二步，利用克隆所得基因进行超表达载体的构建；第三步，将植物超表达载体转入至“GALA
‑
3”植株中。3.如权利要求2所述的提高植物分枝能力的方法，其特征在于，所述第一步的CBF
‑
L基因的单克隆扩增具体包括：(1)PCR扩增CBF
‑
L基因：以上游引物F和下游引物R为引物对，用如下表1中的40微升体系对CBF
‑
L基因进行单克隆扩增，得到CBF
‑
L核苷酸双链；其中，CBF
‑
L基因的CDS序列SEQ ID NO:1；上游引物F的核苷酸序列SE Q ID NO:2；下游引物R的核苷酸序列SEQ ID NO:3；(2)将PCR扩增得到的CBF
‑
L核苷酸双链用10微升体系进行连接PMD
‑
19
‑
T(Simple)载体，在16℃下过夜连接，得到连接产物；(3)连接产物转化感受态细胞：将从
‑
80℃超低温冰箱取出大肠杆菌DH5α感受态细胞，置于冰上融化，吸取20微升的DH5α感受态细胞于1.5mL无菌的的离心管中，加入10微升连接产物，吹打混匀，冰浴30min，42℃水浴热激90s，再冰浴2min，在无菌环境中加入200微升的LB液体培养基，置于37℃、转速为180rpm的摇床中，摇菌1h，30min后将将超净工作台打开进行灭菌，在15min后，开始烧涂布器，一般烧2
‑
3分钟，放到超净工作台上等待至室温；摇菌结束后，取100微升菌液涂LB板，开始涂板，涂板至板子变干为止，盖上盖子封口做好标记，放到37℃恒温培养箱中培养10～12h，待长出菌斑；(4)挑斑：在无菌超净台中，用无菌的枪头吸取100微升LB液体培养基，打入0.5mL的无菌离心管中，用10微升的无菌枪头挑取10个上述菌斑，置于LB液体培养基中，吹打几次，盖上盖子，在离心管上做好标记，放入摇床中，37℃，180rpm，4
‑
6h，得到菌液；(5)菌液鉴定：摇菌结束后用10微升体系进行PCR鉴定，以上述菌液为模板，选用的上游引物为载体的序列，选用的下游引物为基因的下游引物，按照正常的菌批验证流程进行鉴定，以水为阴性对照；跑一个小孔胶，检验菌液的阳性率，挑选阳性鉴定中比较明亮的菌液。4.如权利要求2所述的提高植物分枝能力的方法，其特征在于，所述第二步的构建植物超表达载体CBF
‑
L
‑
pBI121：(1)将阳性的菌液提质粒，得到连有CBF
‑
L的PMD
‑
19
‑
T(Simple)融合质粒；(2)将连有CBF
‑
L的PMD
‑
19
‑
T(Simple)融合质粒和PBI121空载体按照40微升体系进行双酶切，37℃反应2～6h以上，酶切3h；(3)目的基因与目的载体的回收和连接：酶切反应时间结束后，将上述切取目的基因的条带进行胶回收，同时将目的载体的酶切条带也切下进行胶回收，然后用10微升体系对目的基因与目的载体进行连接；(4)将连接产物转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中；然后，将大肠杆菌DH5α感受态细胞从
‑
80℃冰箱中取出，立马放到事先准备好的冰上融化，吸取20微升的大肠杆菌DH5α感受态
细胞于一个的1.5mL的无菌离心管中，吸取构建好的连接产物10微升，吹...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑晓东，边传杰，张勇，孙志娟，王彩虹，田义轲，马长青，刘晓丽，
申请(专利权)人：青岛农业大学，
类型：发明
国别省市：