一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、应用及其检测方法技术

本发明专利技术提出了一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、检测方法及其应用，该表达基因为MYEOV，选取Capan

【技术实现步骤摘要】
一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、应用及其检测方法


[0001]本专利技术属于检测胰腺癌细胞检测
，特别涉及一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、应用及其检测方法。

技术介绍

[0002]近年来发病率不断升高的胰腺癌是致死率最高的恶性肿瘤之一，其表现为早诊难、治疗难和预后差等临床特征，且其高度侵袭和易转移的特点是导致胰腺癌患者死亡的主要原因(仅有20％的确诊患者可接受手术治疗，且术后复发率为80％)。目前超过85％胰腺癌患者被诊断为胰腺导管腺癌(PDAC)。基于肿瘤分子靶向药物在其它肿瘤治疗中所取得的成功经验，已开展了多项针对PDAC患者的靶向或联合治疗研究，但临床治疗效果并不理想，研究表明这与PDAC肿瘤组织的微环境特征有关(如肿瘤组织中PDAC细胞仅占细胞成份的10
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30％，其它成份主要为其招募或激活的免疫细胞及胰腺星状细胞和其分泌的胞外纤维化基质)。
[0003]低氧微环境通常被认为是实体肿瘤组织中的普遍特征，其不仅是实体肿瘤无限制增长的后果，同时也促进了肿瘤进展。研究表明PDAC肿瘤组织中大量沉积的纤维化基质等因素导致其中氧分压中位数显著低于正常胰腺组织，同时也导致新生血管受压迫并影响其血液灌注水平，继而又进一步加剧了PDAC肿瘤组织中的低氧微环境。低氧微环境可通过HIF1激活NF
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κB、MMP
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2、QSOX1、CX3CR1 和LOX等与PDAC细胞侵袭和转移调控相关的基因：如通过增强糖酵解和谷氨酰胺等代谢过程来满足PDAC细胞在转移过程中所需的能量；诱导肿瘤组织中的胰腺星状细胞分泌Col1和POSTN等，继而通过结缔组织增生反应促进免疫抑制和 PDAC转移；诱导PDAC细胞中SHH过表达并刺激胰腺星状细胞分泌SDF
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1，HGF 等，继而通过NF
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κB和c
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Met等途径来促进PDAC细胞的侵袭和转移；通过NOTCH、 HB
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EGF等信号途径诱导侵袭伪足形成，并触发胰腺上皮细胞间质转化过程(EMT) 等。
[0004]本研究前期对TCGA数据库中胰腺癌肿瘤组织的基因表达数据和对应患者预后数据进行了差异表达基因和生存率的相关性分析发现，肿瘤组织中多发性骨髓瘤基因(MYEOV)的表达水平与胰腺癌患者预后的相关性最为显著；同时其它癌种相比，MYEOV在胰腺癌肿瘤组织中的表达水平最高(如图11所示)。本研究前期细胞实验结果显示胰腺癌细胞中MYEOV表达水平与其迁移和侵袭能力存在一定的正相关关系，且低氧微环境可影响其表达水平(如图11所示)。本研究前期通过miRTarBase数据库预测发现miR
‑7‑
5p可以靶向结合MYEOV基因的非编码区；同时文献报道PDAC肿瘤组织中miR
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5p表达水平显著降低，且其对PDAC细胞也具有调控作用。通过STRING蛋白互作分析数据库，本研究前期还发现MYEOV与钙调宁蛋白1(CNN1)相互作用最强(如图11所示)，提示MYEOV 可能存在与钙调宁蛋白结合的结构域。钙调宁蛋白可以与钙调蛋白(CaM)结合来调控细胞骨架，并且CaM对肿瘤细胞Ras信号途径等具有调控作用；同时钙调宁蛋白2(CNN2)表达水平与肿瘤转移有关。因此，进一步揭示MYEOV调控胰腺癌转移的作用机制是必要的。
[0005]MYEOV首次被发现在多发性骨髓瘤细胞系中过表达，并被推测为一个新的原癌基
因，其转录水平可受启动子甲基化水平的调控。研究表明食管鳞癌中MYEOV 与CCND1(其中CCND1被证实参与了胰腺癌细胞系的增殖和转移)存在共扩增现象，但MYEOV的表达水平并未上调；MYEOV通过上调其转录水平可激活TGF
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β信号通路，进而促进非小细胞肺癌的转移，同时其表达水平也与胃癌患者的预后相关；PGE2可通过调控MYEOV的表达水平来促进结肠癌细胞的迁移；最近一项研究通过GSEA基因富集分析和细胞外酸化率实验提示MYEOV可能参与调控了 PDAC细胞的糖酵解过程，但相关调控机制有待进一步揭示。

技术实现思路

[0006]本专利技术提出一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因、应用及其检测方法，解决了上述现有技术中的问题。
[0007]本专利技术的技术方案是这样实现的：一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因，该表达基因为MYEOV。
[0008]一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，选取Capan
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2细胞，以MYEOV 作为表达基因，进行RT
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PCR检测实验，并在进行RT
‑
PCR检测实验之前，先进行细胞培养。
[0009]作为一种优选的实施方式，Capan
‑
2细胞进行细胞培养的方法包括如下步骤：
[0010]步骤10、细胞复苏，37℃快速解冻后，加入完全培养基并离心弃去上清液，再次加入完全培养基后，于37℃，5％CO2的条件下培养；
[0011]步骤11、观察生长情况，当细胞密度达到80％以上时，进行传代；
[0012]步骤12、收集培养基，离心弃去上清液后，补加完全培养基；
[0013]步骤13、细胞量达到107后离心收集细胞，并用PBS洗2次后得到培养后的细胞并待用。
[0014]作为一种优选的实施方式，Capan
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2细胞进行RT
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PCR检测实验的方法包括如下步骤：
[0015]步骤20、对培养后的细胞进行RNA提取，将细胞加入Trizol裂解液进行裂解，吹打混匀后加入氯仿，离心弃去上清液后加入异丙醇颠倒混匀，离心弃去上清液后加入75％乙醇洗涤沉淀，离心弃去上清液后，加入DEPC处理水稀释溶解RNA；
[0016]步骤21、逆转录cDNA，将稀释过的RNA进行RT，其反应体系的总体积为 20μL，其反应条件为42℃40min；
[0017]步骤22、qRT
‑
PCR，将制备好的cDNA进行PCR扩增，其扩增体系的总体积为20μL，其反应条件为94℃10min，40个循环；
[0018]步骤23、荧光定量PCR仪检测，并以GAPDH作为内参，采用2
‑△△
CT
法进行表达量的分析。
[0019]作为一种优选的实施方式，MYEOV包括如SEQIDNO：1所示的上游引物，和如SEQIDNO：2所示的下游引物；
[0020]GAPDH包括如SEQIDNO：3所示的上游引物，和如SEQIDNO：4所示的下游引物。
[0021]一种检测胰腺癌细胞中表达基因的应用，选取Capan
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2细胞，以MYEOV作为表达基因进行Western Blot检测实验，该基因表达量的增加和氧气浓度呈负相关性，和同一氧气浓度下的培养时间呈正相关性。
[0022]作为一种优选的实施方式，Capan
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2细胞进行Western Blot本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种用于检测胰腺癌细胞的表达基因，其特征在于，该表达基因为MYEOV。2.一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，选取Capan
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2细胞，以MYEOV作为表达基因，进行RT
‑
PCR检测实验，并在进行RT
‑
PCR检测实验之前，先进行细胞培养。3.根据权利要求2所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，所述Capan
‑
2细胞进行细胞培养的方法包括如下步骤：步骤10、细胞复苏，37℃快速解冻后，加入完全培养基并离心弃去上清液，再次加入完全培养基后，于37℃，5％CO2的条件下培养；步骤11、观察生长情况，当细胞密度达到80％以上时，进行传代；步骤12、收集培养基，离心弃去上清液后，补加完全培养基；步骤13、细胞量达到107后离心收集细胞，并用PBS洗2次后得到培养后的细胞并待用。4.根据权利要求2所述的一种检测胰腺癌细胞中表达基因的检测方法，其特征在于，所述Capan
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2细胞进行RT
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PCR检测实验的方法包括如下步骤：步骤20、对培养后的细胞进行RNA提取，将细胞加入Trizol裂解液进行裂解，吹打混匀后加入氯仿，离心弃去上清液后加入异丙醇颠倒混匀，离心弃去上清液后加入75％乙醇洗涤沉淀，离心弃去上清液后，加入DEPC处理水稀释溶解RNA；步骤21、逆转录cDNA，将稀释过的RNA进行RT，其反应体系的总体积为20μL，其反应条件为42℃40min；步骤22、qRT
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PCR，将制备好的cDNA进行PCR扩增，其扩增体系的总体积为20μL，其反应条件为94℃10min，40个循环；...

【专利技术属性】
技术研发人员：王晓敏，郑亮，许腾，朱兵，张茂，
申请(专利权)人：包头市中心医院内蒙古自治区脑血管病研究所，
类型：发明
国别省市：