耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株及构建方法和应用，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB18，其保藏号为：CGMCC NO.22588，构建方法为：以菌株SEB14为出发菌株，将菌株SEB14的将转录因子Crz1p的启动子替换为TEF1的启动子，构建菌株SEB18。本发明专利技术所述菌株SEB18具有多重耐受性，同时具有耐受高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。多种环境胁迫下物料发酵。多种环境胁迫下物料发酵。

【技术实现步骤摘要】
耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株及构建方法和应用


[0001]本专利技术涉及生物工程
，具体涉及耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株及构建方法和应用。

技术介绍

[0002]近年来，随着化石能源的不断消耗以及严重的环境问题，发展可再生清洁生物能源成为我国能源开发的重要任务。燃料乙醇相比传统汽油，具有更高的辛烷值，被认为是一种极具潜力的重要液体燃料。工业上，若能实现有机废弃物能源化利用将能极大的推进燃料乙醇的发展。目前，适用于燃料乙醇生产的有机废弃物主要包括秸秆等纤维素原料和废糖蜜等糖质原料。在秸秆同步糖化发酵(SSF)过程中，为了提高纤维素酶的活性，常采用高温SSF发酵，然而这将给酵母带来巨大损伤阻碍乙醇生产。而在糖蜜的超高浓度发酵(VHG)过程中，较高的盐分和灰分等物质严重阻碍了酵母的发酵，因此，选育具有耐高温、耐高糖和耐高盐的酿酒酵母菌株将有助于提高乙醇产量，降低生产成本。

技术实现思路

[0003]本专利技术的目的在于提供耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株，该菌株具有多重耐受性，同时具有耐受、高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
[0004]此外，本专利技术还提供耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株的构建方法和应用。
[0005]本专利技术通过下述技术方案实现：
[0006]耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏名称为SEB18，其保藏号为：CGMCC NO.22588，分类命名为Saccharomyces cerevisiae,保藏日期为2021年5月24日，保藏地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。
[0007]本专利技术所述菌株SEB18具有多重耐受性，同时具有耐受高温、高糖、高盐等多种环境胁迫的优点，能够适用于多种环境胁迫下物料发酵。
[0008]耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株的构建方法，以具有良好耐受性的工业酿酒酵母菌株SEB14为出发菌株，将转录因子Crz1p的启动子替换为在各胁迫下表达量较高且稳定的TEF1的启动子，获得高表达转录因子Crz1p的菌株SEB18。
[0009]转录因子Crz1p与酿酒酵母抵抗高盐、高pH和低温等多种胁迫密切相关，本专利技术首次发现高表达转录因子Crz1p对于酿酒酵母的耐高温、耐高糖和耐高盐等耐受表型的提升也至关重要。
[0010]具体地：
[0011]出发菌株：
[0012]出发菌株SEB14保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.19587。
[0013]培养基：
[0014]所用培养基如表1所示。若培养基为固体培养基，则在灭菌前加入2.0％的琼脂粉。灭菌条件为121℃，15min。所有的抗生素均在培养基灭菌后，待冷却至50～60℃后添加。
[0015]表1培养基组成
[0016][0017]质粒、菌株及引物：
[0018]以良好耐受性的工业菌株SEB14(菌株保藏号：CGMCCNo.19587)为出发菌株，通过启动子替换的方法，将基因CRZ1过表达获得菌株SEB18，其中所用质粒和菌株如表2所示；菌株转化所用引物及片段如表3所示；用于构建gRNA质粒的所需的同源壁序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列如表4所示。
[0019]表2构建菌株SEB18过程中所用质粒及菌株信息
[0020][0021]表3菌株转化所需引物及片段
[0022][0023][0024]注：TG:gRNA加同源臂引物，RF：修复片段，Vp：验证引物；F：上游引物；R：下游引物
[0025]TEF1 F的序列号为SEQ ID No.1，TEF1 R的序列号为SEQ ID No.2，CRZ1 TG F的序列号为SEQ ID No.3，CRZ1 TG R的序列号为SEQ ID No.4，CRZ1 RF F的序列号为SEQ ID No.5，CRZ1 RF R的序列号为SEQ ID No.6，CRZ1 V
P F的序列号为SEQ ID No.7，CRZ1 V
P R的序列号为SEQ ID No.8，Cas9
‑
dg
‑
F的序列号为SEQ ID No.9，Cas9
‑
dg
‑
R的序列号为SEQ ID No.10，6006
‑
F的序列号为SEQ ID No.11，6005
‑
R序列号为SEQ ID No.12。
[0026]表4构建gRNA所需的同源臂序列和PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列
[0027][0028]注：N20：gRNA所含的PAM位点(NGG)上游的20bp的目标序列；下划线：PAM位点(NGG)
[0029]tgR F的序列号为SEQ ID No.13，tgR R的序列号为SEQ ID No.14，CRZ1的序列号为SEQ ID No.15。
[0030]菌株SEB18的构建：
[0031]1)、TEF1启动子(修复片段)的扩增
[0032]以菌株SEB14的基因组DNA为模板，通过PCR扩增TEF1启动子(修复片段)(表5)。PCR
反应体系和反应条件如表6所示。RF F/RF R为包含同源臂的TEF1的引物，序列如表3所示。利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察目标条带。将所得PCR产物保存于
‑
20℃冰箱，备用。
[0033]表5 TEF1启动子基因序列表
[0034][0035]表6 PCR扩增TEF1启动子(修复片段)注：P
TEF1
的序列号为SEQ ID No.16。
[0036][0037]2)、构建双链gRNA片段：
[0038]在Saccharomyces Genome Database网站上查询目标基因启动子区域的碱基序列。再将该序列输入到Yeastriction，查找目标片段上PAM位点(NGG)上游的20bp目标序列。将包含上下游50bp同源臂和20bp目标序列(共120bp)的gRNA片段进行合成(片段序列见表3。待合成之后，用灭菌水稀释至10μM，后将两条互补链溶液按1：1混合(体积比)，于水浴锅中95℃热击5min，获得双链gRNA片段。
[0039]3)、扩增gRNA线性骨架
[0040]以pMEL13质粒为模板，扩增gRNA的线性骨架，PCR反应体系和反应条件如表7所示。利用1.5％的琼脂糖凝胶对PCR产物进行电泳(100V，32min)，于EB染液中染色40min，紫外灯下观察是否有目标条带。将所得PCR产物保存于
‑
20℃冰箱，备用。
[0041]表7 PCR扩增gRNA线性骨架
[0042本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株，其特征在于，所述酿酒酵母菌株保藏于中国微生物菌种管理委员会普通微生物中心，保藏名称为SEB18，其保藏号为：CGMCC NO.22588。2.如权利要求1所述的耐高温、耐高糖、耐高盐酿酒酵母菌株的构建方法，其特征在于，以菌株SEB14为出发菌株，将菌株SEB14的将转录因子Crz1p的启动子替换为TEF1的启动子，构建菌株SEB18。3.采用权利要求1...

【专利技术属性】
技术研发人员：汤岳琴，王莉，谢采芸，苟敏，孙照勇，夏子渊，
申请(专利权)人：四川大学，
类型：发明
国别省市：