一种细胞诱导的方法技术

一种细胞诱导的方法，具体来说涉及：诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂和BMP4，继续培养，直至得到脂肪细胞。还涉及一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的方法及其应用。所述方法包括以下步骤：将成纤维细胞培养在培养基中，在培养基中加入Myosin抑制剂，继续培养，直至得到永生化细胞。还涉及一种诱导肝细胞体外扩增的方法。还涉及Myosin抑制剂尤其是(

【技术实现步骤摘要】
一种细胞诱导的方法
[0001]本案是申请日为2019年1月29日、申请号为201980005643.6、专利技术 名称为“一种细胞诱导的方法”的专利技术专利申请的分案申请。


[0002]本专利技术涉及生物
，具体涉及细胞诱导
，更具体涉及 一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的方法及其应用、一种将成纤维细 胞转化为永生化细胞的方法及其应用、以及一种诱导肝细胞体外扩增的方 法。

技术介绍

[0003]转分化(transdifferentiation，也称为分化转移)是指一种类型的分化细胞 转变成另一种类型的分化细胞的现象。目前已经可以实现多种类型的细胞 的转分化，例如：将胚胎成纤维细胞、成软骨细胞和视网膜上皮细胞转分 化为肌细胞，将B淋巴细胞转分化为巨噬细胞，将小鼠成纤维细胞转分化 为功能性的神经细胞等等。
[0004]脂肪细胞(adipocyte)在成人体内大量存在，其组织又称脂肪组织，常呈 白色，在幼儿期大量增殖，到青春期数量达到巅峰，此后数量一般不再增 加。在正常动物和人类的体内，脂肪组织主要存在于腹腔内和腹部的皮下 内，但肥胖患者的机体各个部位均会出现脂肪组织，如肾脏、肠系膜、皮 下、腹腔等部位的周围，这表明可能分化为脂肪细胞的细胞不仅有脂肪前 体细胞，在一些特定条件下，一些非脂肪前体细胞也能够分化为脂肪细胞， 这颠覆了脂肪细胞是由脂肪前体细胞分化而来的传统观念。通过将非脂肪 前体细胞转分化为脂肪细胞，也可以更清楚地了解脂肪细胞的转化机制， 进而指导抑制肥胖药物的开发。
[0005]成纤维细胞(fibroblast)是疏松结缔组织的主要细胞成分，由胚胎时期的 间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。将成纤维细胞转分化为脂肪细胞在 诸多领域具有重要的应用，例如，将疤痕伤口中发现的最常见类型的肌成 纤维细胞转分化为脂肪细胞可能在未来实现伤口不留疤痕，并且在皱纹皮 肤中再生脂肪细胞，有可能衍生出新型抗衰老治疗策略。由此可见，实现 非脂肪前体细胞尤其是成纤维细胞转分化为脂肪细胞具有重要的意义。
[0006]目前，现有技术已经公开了一些诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的 方法。CN104342401B公开了利用确定的细胞因子组合促进成纤维细胞转分 化为脂肪细胞的方法，组合物的起效因子为表皮生长因子、肝细胞生长因 子、地塞米松、胰岛素和PPARγ激动剂。CN104372024A公开了一种诱导 牛成纤维细胞/成肌细胞转分化为脂肪细胞的方法，包括克隆牛转录因子 CCAAT增强子结合蛋白C/EBPβ基因，构建C/EBPβ基因过表达载体并包 装获得重组腺病毒，腺病毒侵染牛成纤维细胞、成肌细胞实现上述细胞快 速转分化为脂肪细胞。上述方法采用大量大分子物质或重编程过程，效率 较低，安全性也存在一定的影响。
[0007]现已证实，小分子化合物也可以诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞， 这能够提高转分化的速度、存活率和能力。例如，CN105754935A公开了一 种诱导成纤维细胞转分化为
脂肪细胞的诱导培养基，所述培养基包含基础 培养基和诱导小分子组合，所述诱导小分子组合为SG或6TF，其中S为 SB431542、G为GSK126、6为E61541、T为苯环丙胺、F为毛喉素。但仍 然需要探索更多的小分子化合物来诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞以用 于疾病的研究、治疗和更广泛的应用。
[0008]正常组织来源的体细胞在通常的体外培养条件下可生长和分裂，但经 过有限次的细胞传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这就限制了细 胞培养技术的应用。细胞永生化(cell immortalization)是指细胞在体外培养过 程中，由于自身基因变化或者各种外界刺激因素，从增殖衰老的危机中逃 离，避免了正常细胞的衰老死亡过程，可以长期传代培养、无限分裂增殖。
[0009]对于细胞永生化的机制和方法已经进行了大量的研究，已经证实，放 射性因素、端粒酶激活、病毒基因转染、原癌基因与抑癌基因等均可以导 致细胞的无限增殖分裂。但经过多年的研究发现，虽然永生化的机制有相 似之处，但同样的永生化方法并非适用于所有细胞。例如，肝细胞永生化 的方法有抑癌基因敲除、质粒转导和病毒转染、可恢复性永生化等，上皮 细胞永生化的方法有DNA致瘤病毒转染等，心肌细胞永生化的方法有P16 慢病毒载体和可逆SV40病毒转导途径成功的案例。
[0010]目前，现有技术已经披露了一些诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的 方法。王新文等(“皮肤成纤维细胞永生化的研究进展”，中国生物工程杂质， 第22卷第4期，2002年8月)披露了皮肤成纤维细胞永生化的方法，除了 以上常用的方法外，总的概括起来还有以下几种方法：HPV、四硝基喹啉 一氧化物、黄曲霉素等。
[0011]针对性发展对特定细胞的永生化技术可以实现具有传代次数少、增殖 分裂慢的正常体细胞的长期传代、无限分裂增殖，增加细胞周期寿命。这 不仅有助于了解细胞生长规律、探索细胞衰老原因，还对解决器官移植问 题有着重要的临床意义。
[0012]另外，资料显示，细胞永生化是转化为肿瘤细胞的前提，是由正常细 胞转化为肿瘤细胞所必经的阶段，研究细胞的永生化可以为治疗肿瘤、控 制肿瘤细胞的增殖奠定坚实的基础。
[0013]因此，针对成纤维细胞转化为永生化细胞的研究有着广阔的应用前景。
[0014]肝脏是人体内最大的内部器官，其是代谢的主要场所。肝细胞在肝脏 中占85％。肝细胞在体内具有强大的再生潜能，将正常的肝脏切除三分之 二后可以在仅一周内通过细胞增殖恢复到原来体积。然而，遗憾的是，尽 管人类肝脏在体内可以迅速再生，但原代肝细胞在体外培养条件下仅能短 暂增殖而不能长期增殖，到目前为止，努力在实验室扩展人类肝细胞会导 致代谢功能低的永生化癌细胞。人体肝细胞的稀缺和肝细胞扩展时功能丧 失是科学、医学和药学发展的主要瓶颈，解决这一问题将有助于促进肝细 胞体外药物代谢、药物毒性、终末期肝病细胞治疗、构建出生物人工肝来 支持等待移植的患者、疾病模型构建等研究和应用。
[0015]目前，该领域内最常用的方法为转录因子重编程技术，但是此类技术 由于外源基因片段的插入使得进入临床应用的风险较大。前期有研究发现， 采用小分子重编程技术，中日两个研究团队分别成功地实现了原代肝细胞 在体外向肝前体细胞的转变和快速增殖，经定向诱导分化后，增殖的前体 样肝细胞可重新获得成熟肝细胞的功能，移植入小鼠体内可达70％以上的 整合。采用小分子化合物重编程技术，所得到的肝细胞未经过任何的
基因 改造，因而更为接近体内细胞的初始状态，对于将来的临床应用更为安全 有效。该领域仍然存在使用小分子化合物来诱导肝细胞体外扩增的强烈需 求。

技术实现思路

[0016]本专利技术人经过不断的探索，意外地发现可以通过Myosin抑制剂 (
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Blebbistatin或(S)
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【技术保护点】

【技术特征摘要】
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Blebbistatin或(
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Blebbistatin O
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Benzoate在构建生物人工肝中的应用。2.(
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Benzoate在构建肝脏疾病模型中的应用。3.一种诱导成纤维细胞转分化为脂肪细胞的培养基，其包括：(
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Blebbistatin O
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Benzoate、BMP4、基础培养液、胎牛血清和脂肪诱导培养液。4.如权利要求3所述的培养基，其中，所述基础培养液包括高糖DMEM、胎牛血清和双抗，和/或，所述脂肪诱导培养液包括N2B27培养液(DMEM/F12、Neurobasal的1:1混合物)、N2添加剂、B27添加剂、2％牛血清白蛋白、β
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巯基乙醇、Glutamax、胰岛素和双抗，以及血清替代物。5.如权利要求3或4任一项所述的培养基，其中，所述脂肪诱导培养液进一步包括A83
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01和/或SB431542。6.一种诱导成纤维细胞转化为永生化细胞的培养基，其包括：(
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Blebbistatin或(
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【专利技术属性】
技术研发人员：周琪，李伟，何正泉，王柳，
申请(专利权)人：中国科学院动物研究所，
类型：发明
国别省市：