睾丸特异性表达蛋白ARAP1在乳腺癌诊断和治疗中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物医药领域。本发明专利技术属于医学检测技术领域，具体涉及一种乳腺癌细胞生长、侵袭和转移能力的标志物及其应用。ARAP1，研究发现该蛋白在正常组织中只有睾丸组织表达，但ARAP1在乳腺癌中表达量显著增高。本发明专利技术首次公开ARAP1可以与雄激素受体AR相互作用。对其作用机制进行研究发现ARAP1可以显著下调雄激素受体AR的转录活性，且ARAP1沉默可以显著激活AR下游的抑癌基因。ARAP1的功能研究为乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。对于ARAP1的靶向药物开发和靶向沉默具有重要的临床价值。床价值。床价值。

【技术实现步骤摘要】
睾丸特异性表达蛋白ARAP1在乳腺癌诊断和治疗中的应用


[0001]本专利技术属于医学检测
，具体涉及一种乳腺癌细胞生长、侵袭和转移能力的标志物及其应用。

技术介绍

[0002]雄激素受体（AR）在ER阳性乳腺癌中约有60%病例中表达，近年来，越来越多的研究表明AR的转录辅调节因子对AR下游基因表达的调控在抑制乳腺癌的增殖和内分泌耐药过程中十分关键。因此，鉴定和解析AR辅调节因子在AR介导基因转录中的表观遗传学机制越来越受到关注，对于进一步研究肿瘤治疗中潜能药物靶点也具有重要的科学意义。
[0003]女性乳腺癌是发生于女性乳腺上皮细胞的恶性肿瘤，其发病率在2020年统计已超过肺癌位居第一，其致死率位居第二位。临床病人中按照分子分型，雌激素受体（ER）阳性乳腺癌占总体乳腺癌病例的75%。得益于ER表达为阳性，这类患者通常采用靶向ER
‑
E2信号通路的新辅助内分泌治疗来缓解癌症的进展。临床研究发现，有近三分之一的病人呈现固有的内分泌治疗抵抗，有一半的病人在经历长期内分泌治疗后发生远处转移并恶性增殖。针对ER阳性乳腺癌的治疗终末期一般都存在着不可逆性的内分泌药物抵抗。
[0004]由于乳腺癌的高度异质性，不同病人和同一病人的不同时期的的治疗方案都存在着巨大差异，早期发现和分型乳腺癌十分重要。但是目前关于早期ER阳性乳腺癌的诊断相关分子标志物很少，导致对于判断ER阳性乳腺癌的疾病进展和预后很难从而耽误病情拖延。

技术实现思路

[0005]针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种新的可以与雄激素受体AR相互作用的蛋白ARAP1，研究发现该蛋白在正常组织中只有睾丸组织表达。对其作用机制进行研究发现ARAP1可以显著下调AR的转录活性，且ARAP1沉默可以显著上调AR下游的抑癌基因。
[0006]为了实现上述目的，本专利技术提供了如下技术方案。
[0007]本专利技术提供了一种检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用。
[0008]进一步地，所述ARAP1基因或其编码蛋白在乳腺癌细胞中呈现高表达。
[0009]进一步地，所述应用通过RT
‑
PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平；所述样本为组织、血清或细胞。
[0010]进一步地，所述应用中含有扩增ARAP1基因的特异性引物、与ARAP1基因核苷酸序列杂交的探针或与ARAP1蛋白特异性结合的抗体。
[0011]更近一步地，扩增ARAP1基因的特异性引物序列如下：ARAP1
‑
F：5
’‑
AGAGTCCCAGGCAGGACAA
‑3’
；ARAP1
‑
R：5
’‑
GCAGAAGGCTGAGGAACACT
‑3’
；
所述抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。
[0012]根据上述任一所述的应用，其特征在于，所述乳腺癌指ER阳性乳腺癌。
[0013]本专利技术还提供一种ARAP1基因的表达抑制剂在制备治疗乳腺癌的药物中的应用。
[0014]进一步地，所述ARAP1基因抑制剂的靶向序列为：5
’‑
TGGATTTGTACCATTCTTCT
‑3’
。
[0015]进一步地，所述抑制剂包括含有上述所述靶序列的siRNA或shRNA。
[0016]进一步地，所述药物包含药学上可以接受的载体和/或赋型剂。
[0017]与现有技术相比本专利技术的有益效果。
[0018]雄激素受体（AR）在ER阳性乳腺癌中约有60%病例中表达，在ER阳性乳腺癌中AR可以改变ER在染色质上的定位从而直接影响ER下游促癌基因转录活性，进而发挥抑癌作用。雄激素作为已知的AR的配体也曾应用于临床ER阳性乳腺癌的治疗，提示我们雄激素和雄激素受体在ER阳性乳腺癌中其抑制癌症的作用。
[0019]与现有技术相比，本专利技术运用网络数据、蛋白免疫印迹实验、蛋白免疫共沉淀实验、GST
‑
Pulldown实验、免疫荧光共定位实验、荧光素酶双基因报告实验、实时定量PCR实验、细胞生长曲线实验和细胞transwell实验等现代分子生物学技术。成功构建了靶向ARAP1基因干扰siRNA，在细胞水平检测了干扰ARAP1基因后对乳腺癌细胞生长和侵袭转移能力的影响，本专利技术提供的试剂盒，可用于检测乳腺癌生长增殖和侵袭转移能力，具有很好的实用性。
[0020]本专利技术首次发现了AR相互作用蛋白ARAP1与乳腺癌细胞增殖和侵袭转移有关，其表达量一定程度上反应乳腺癌的发生发展程度，为乳腺癌的治疗提供了新的思路和新的方案。
附图说明
[0021]图1ARAP1特异性表达研究。
[0022]图2 ARAP1与雄激素受体AR相互作用。
[0023]图3ARAP1下调AR介导的基因转录。
[0024]图4ARAP1的沉默可以促进癌细胞增殖。
[0025]图5 ARAP1的沉默可以显著促进乳腺癌细胞的侵袭和转移。
具体实施方式
[0026]为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。
[0027]本专利技术披露了一种用于检测乳腺癌细胞生长和侵袭转移能力的分子标志物及其应用，具体如下各实施例所示。本专利技术中涉及的乳腺癌癌细胞系：MCF7，购于上海中科院细胞库。ARAP1抗体购自Cellsignaltechnology公司。实时定量PCR方法参照TIANGEN说明书提取细胞总RNA，测浓度后，按TaKaRa公司Prime ScriptRT Master Mix试剂盒进行反转录，按appliedbiosystems公司SYBR Select Master Mix试剂盒检测相关基因表达(ACTB为内参)。靶向ARAP1的siRNA及shRNA合成由吉凯公司购买。转染方法按Invitrogen公司LipofectamineRNAiMAX Reagent转染试剂说明书进行，q
‑
PCR及Western blot方法检测表
达及干扰效果。细胞迁移实验Transwell(8mm孔径)小室购自Cosar公司，事先进行饥饿培养。细胞划痕实验所使用12孔板购自Cosar公司。
[0028]实施例1细胞复苏、培养、转染及蛋白免疫共沉淀实验(co
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IP)检测MCF7细胞株中ARAP1蛋白与雄激素受体AR蛋白的相互作用。
[0029]细胞复苏：从液氮取出MCF7细胞，立即放入37℃水浴箱中快速融化，使细胞在最短时间内完全解冻。用75％酒精擦拭消毒本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用。2.根据权利要求1所述检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用，其特征在于，所述ARAP1基因或其编码蛋白在乳腺癌细胞中呈现高表达。3.根据权利要求1所述检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用通过RT
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PCR、实时定量PCR、原位杂交、Northern blotting、芯片、高通量测序平台、免疫组织化学或酶联免疫吸附检测样本中ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平；所述样本为组织、血清或细胞。4.根据权利要求1所述检测ARAP1基因或其编码蛋白的表达水平的试剂在制备诊断筛查乳腺癌试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用中含有扩增ARAP1基因的特异性引物、与ARAP1基因核苷酸序列杂交的探针或与ARAP1蛋白特异性结合的抗体。5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，扩增ARAP1基因的特异性引物序列如下：ARAP1
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F：5

【专利技术属性】
技术研发人员：孙戈，王安琦，张博涵，李佳璇，白雨，王曼霖，栾瑞娜，周宝生，
申请(专利权)人：中国医科大学，
类型：发明
国别省市：