一种鉴别火把花根与其混伪品的引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种鉴别火把花根与其混伪品的引物及方法，包括有引物对ITS2F和ITS3R，其中正向引物ITS2F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物ITS3R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；通过分别提取火把花根与其混伪品的基因组DNA；分别以提取的取火把花根与其混伪品的基因组DNA为扩增模板，以引物对ITS2F和ITS3R作为引物，进行PCR扩增，分别得到取火把花根与其混伪品的扩增产物；将所得的各测序峰图利用CodonCode Aligner V 6.0.2软件并基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法获得火把花根与其混伪品的内部转录间隔区ITS2序列从而分别绘测出火把花根与其混伪品的ITS2二级结构，通过对比火把花根与其混伪品的ITS2二级结构快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴别火把花根与其混伪品的引物及方法


[0001]本专利技术属于药用植物和中药鉴定领域，具体涉及一种鉴别火把花根与其混伪品的引物及方法。

技术介绍

[0002]火把花根为卫矛科雷公藤属植物昆明山海棠Tripterygium hypoglaucum(Levl.)Hutch去皮的根心。火把花根祛风除湿，舒筋活络，清热解毒。具有抗炎和免疫抑制作用，用于类风湿性关节炎、红斑狼疮、原发性肾病综合症、糖尿病肾病等领域，并取得了相当不错的临床疗效。
[0003]火把花根药材目前主要分布于长江流域至西南地区，分布的经度范围较广，东经99
°
～122
°
，北纬21
°
～31
°
的区域，其药材目前基本上来自于野生，其野生蕴藏量在1.5万吨左右，但火把花根药材生长成为达到药用标准中药材的时间超过10年甚至更长。据初步估算和野外调查，目前火把花根药材市场年需求量一般为1000吨左右，加之由于人口和经济压力增加，产地普遍开荒垦坡，以及经济林建设和林分改造等，火把花根原生生境遭到极大破坏，野生种群恢复破碎化和边缘化非常严重，资源逐渐枯竭。火把花根与雷公藤等都属于卫矛科植物雷公藤属，两者的化学成分以及药理作用都非常相似，并且火把花根的毒性远远小于雷公藤等药材，市场上有些供应商常常将火把花根药材和雷公藤等其他药材互相充当使用，并且药用部位都是根部，由于外形极为相似、鉴定者知识局限等多方面因素，导致火把花根与雷公藤、东北雷公藤、南蛇藤等药材难以区别，严重影响了市场混乱以及用药准确与安全。为保证用药安全，需要一种更能精准、可靠、快速的方法用于鉴别火把花根与其混伪品。
[0004]自2010年来，由陈士林院士等首次提出利用DNA条形码来鉴别药用植物，并且该技术在药用植物鉴定方向得到了极大的应用和发展，DNA条形码技术具有简单高效，不受样品的外观形态以及研究者的专业限制，可较好、较快地适用于中药材或植物的真伪鉴别。目前，关于火把花根的研究大多在其临床、化学成分、药理药效的研究上，对其药材的鉴别还是运用传统的性状等方法进行鉴别，由于市场上根类药材都基本一样，鉴定难度较大。随着分子生物学的发展，越来越多的分子生物鉴别方法运用到中药材的鉴别上，因此，本专利技术利用分子鉴别技术对火把花根药材与其混伪品(雷公藤、东北雷公藤、南蛇藤、金樱根、苦皮藤)进行鉴定，为火把花根药材的鉴别提供了有效手段，更为后期药品的质量提供了有效保障。

技术实现思路

[0005]针对上述的不足，本专利技术的第一目的是提供一种鉴别火把花根与其混伪品的引物；
[0006]本专利技术的第二目的是提供一种利用引物鉴别火把花根与其混伪品的方法；
[0007]为实现上述目的，本专利技术采取以下技术方案：
[0008]一种鉴别火把花根与其混伪品的引物，包括有引物对ITS2F和ITS3R，其中正向引物ITS2F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物ITS3R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0009]进一步地，具体步骤如下：
[0010]1)分别提取火把花根与其混伪品的基因组DNA；
[0011]2)分别以步骤1)中提取的取火把花根与其混伪品的基因组DNA为扩增模板，以引物对ITS2F和ITS3R作为引物，进行PCR扩增，分别得到取火把花根与其混伪品的扩增产物；
[0012]3)分别将步骤2)中的各扩增产物利用3％琼脂糖凝胶进行电泳检测其DNA纯度，并将扩增好的DNA进行双向测序；
[0013]4)分别将步骤3)中所得的各测序峰图利用CodonCode Aligner V 6.0.2软件进行校对拼接，除去引物区，然后基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法将所有测得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去两端的5.8S和28S区，从而分别获得火把花根与其混伪品的内部转录间隔区ITS2序列；
[0014]5)分别将火把花根与其混伪品的ITS2序列与在GenBank上下载的序列，通过MEGA6.0软件进行序列的比对分析，并计算K2P种间遗传距离建立NJtree，同时利用bootstrap重复检验各分支的支持率，使用PseudoViewer2.5，结合ITS2序列分别绘测出火把花根与其混伪品的ITS2二级结构，通过对比火把花根与其混伪品的ITS2二级结构快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。
[0015]进一步地，所述引物对ITS2F和ITS3R中ITS2F为正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ITS3R为反向引物，核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。
[0016]进一步地，所述火把花根的混伪品包括有雷公藤、东北雷公藤、苦皮藤、南蛇藤、金樱根中的一种或多种。
[0017]进一步地，所述火把花根的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述雷公藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述东北雷公藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述苦皮藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.6所示，所述南蛇藤的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.7所示，所述金樱根的ITS2核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
[0018]进一步地，步骤1)中所述提取火把花根与其混伪品的基因组DNA提取方法为：采用75％乙醇分别擦洗火把花根与其混伪品的表面，并将其分别粉碎成细分，分别取火把花根与其混伪品各60mg，分别加入液氮后，用全自动快速球磨仪研磨5min，30次/s，分别得到火把花根与其混伪品的样品；
[0019]利用优化后的植物DNA提取试剂盒，分别对火把花根与其混伪品的样品按照试剂盒说明操作提取样品总DNA，即得分别提取的火把花根与其混伪品样品的DNA模板。
[0020]进一步地，所述优化后的植物DNA提取试剂盒包括有以下试剂：氯仿、缓冲液GP1、冷冻异丙醇、吸附柱CB3、缓冲液GD、漂洗液PW。
[0021]进一步地，步骤2)中所述PCR扩增反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，退火最佳温度为56℃，30s；72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min。
[0022]采用以上方案，本专利技术具有如下优点：
[0023]1、与目前现有的性状、显微技术鉴别火把花根药材与其混伪品相比，本专利技术优点在于火把花根ITS2条形码结合二维结构能更加准确、高效地、快速地用于火把花根、雷公
藤、东北雷公藤、苦皮藤、南蛇藤及金樱根等物种之间的鉴别，为火把花根药材以及其混伪品的真伪鉴别提供有效的手段，同时为药品监管部门提供可靠手段，更为其相应药品后期的质量控制研究提供有效保障；
[0024]2、本专利技术考虑到根类药材富含多糖、黏液质成分，对后期的PCR有一定的干扰，本专利技术对植物DNA试剂盒提取方法进行了优化，将沉淀试剂改为氯仿，缓冲液GP2换成冷冻异丙醇(
‑
20℃)，这样能有效地沉淀样品中的多糖等成分，得到本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种鉴别火把花根与其混伪品的引物，其特征在于，包括有引物对ITS2F和ITS3R，其中正向引物ITS2F的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，反向引物ITS3R的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。2.一种根据权利要求1所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，具体步骤如下：1)分别提取火把花根与其混伪品的基因组DNA；2)分别以步骤1)中提取的取火把花根与其混伪品的基因组DNA为扩增模板，以引物对ITS2F和ITS3R作为引物，进行PCR扩增，分别得到取火把花根与其混伪品的扩增产物；3)分别将步骤2)中的各扩增产物利用3％琼脂糖凝胶进行电泳检测其DNA纯度，并将扩增好的DNA进行双向测序；4)分别将步骤3)中所得的各测序峰图利用CodonCode Aligner V 6.0.2软件进行校对拼接，除去引物区，然后基于隐马尔夫模型的HMMer注释方法将所有测得的序列用CodonCode Aligner V 6.0.2除去两端的5.8S和28S区，从而分别获得火把花根与其混伪品的内部转录间隔区ITS2序列；5)分别将火把花根与其混伪品的ITS2序列与在GenBank上下载的序列，通过MEGA6.0软件进行序列的比对分析，并计算K2P种间遗传距离建立NJtree，同时利用bootstrap重复检验各分支的支持率，使用PseudoViewer2.5，结合ITS2序列分别绘测出火把花根与其混伪品的ITS2二级结构，通过对比火把花根与其混伪品的ITS2二级结构快速准确地鉴别出火把花根与其混伪品。3.根据权利要求2所述的引物对鉴别火把花根与其混伪品的方法，其特征在于，所述引物对ITS2F和ITS3R中ITS2F为正向引物，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，ITS3R为反向引物，核苷酸序列如SEQ ID...

【专利技术属性】
技术研发人员：王江瑞，蔡蓓蕾，王学政，赵建权，欧洪，
申请(专利权)人：重庆市药研院制药有限公司，
类型：发明
国别省市：