一种引物组合物、试剂盒和应用制造技术

本申请涉及植物鉴定技术领域，提供了一种引物组合物、试剂盒和应用。引物组合物包括正向引物和反向引物；其中，正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增金银花、灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花的psbA

【技术实现步骤摘要】
一种引物组合物、试剂盒和应用
[0001]本申请要求于2021年09月02日提交中国专利局、申请号为202111027244.5、专利技术名称为“一种引物组合物、试剂盒和应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。


[0002]本申请涉及植物鉴定
，特别是涉及一种引物组合物、试剂盒和应用。

技术介绍

[0003]金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)干燥花蕾或待初开的花，为我国常用大宗药材之一。忍冬科植物灰毡毛忍冬(Lonicera macranthoides)、红腺忍冬(Lonicera hypoglauca)、华南忍冬(Lonicera confuse)或黄褐毛忍冬(Lonicera fulvotomentosa)的干燥花蕾或待初开的花统称为山银花。淡红忍冬(Lonicera acuminata)的花是另一种忍冬科忍冬属植物的干燥花蕾或待初开的花。
[0004]在中药材市场上，金银花价格较高，导致中成药金银花成分中掺伪的情况较为严重，比如掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花等。由于这些物种的花的形状特征比较相似，加上中成药中添加的成分往往经过蒸煮、研磨、提取等工序，添加成分已失去原有性状特征，导致采用常规方法鉴定时，容易受到主观影响而判断不准确。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定金银花中是否掺有混伪品的方法。

技术实现思路

[0005]本申请的目的在于提供一种引物组合物，以通过对金银花及其混伪品中psbA
‑
trnH区域内特定序列的特异性扩增，从而实现金银花及其混伪品的准确鉴定。具体技术方案如下：
[0006]本申请提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。
[0007]本申请还提供了上述引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。
[0008]本申请还提供了一种采用上述引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA
‑
trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。
[0009]在一些实施例中，PCR扩增体系中包括：0.1
‑
0.3μmol/L正向引物；0.1
‑
0.3μmol/L反向引物；2
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10ng/μL模板DNA；50
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150μmol/L dNTPs；0.02
‑
0.03U/μL DNA聚合酶。
[0010]在一些实施例中，PCR扩增的条件包括：预变性：97
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98℃，50
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70s；变性：97
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98℃，8
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12s；退火：54
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56℃，13
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17s；延伸：67
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69℃，25
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35s；35
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45个循环；完成循环后继续67
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69℃延伸4
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6min。
[0011]本申请还提供了一种采用上述引物组合物定量鉴定金银花及其混伪品的方法，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用引物组合物，以待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将ASV序列与金银花及其混伪品的psbA
‑
trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种；分别统计金银花和混伪品对应的ASV序列数目，然后经过换算金银花和混伪品的质量比值。
[0012]在一些实施例中，PCR扩增体系中包括：0.1
‑
0.3μmol/L正向引物；0.1
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0.3μmol/L反向引物；2
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10ng/μL模板DNA；50
‑
150μmol/L dNTPs；0.02
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0.03U/μL DNA聚合酶。
[0013]在一些实施例中，PCR扩增的条件包括：预变性：97
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98℃，50
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70s；变性：97
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98℃，8
‑
12s；退火：54
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56℃，13
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17s；延伸：67
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69℃，25
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35s；35
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45个循环；完成循环后继续67
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69℃延伸4
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6min。
[0014]本申请还提供了一种用于鉴定金银花及其混伪品的试剂盒，试剂盒中包括上述引物组合物；其中，混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。
[0015]在一些实施例中，试剂盒中还包括PCR缓冲液、DEPC水、DNA聚合酶、dNTPs，及操作说明书。
[0016]本申请提供的引物组合物，可以用于特异性扩增金银花、灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花的psbA
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trnH区域内特定序列，从而准确鉴定出金银花中是否掺有灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花或淡红忍冬的花。
[0017]当然，实施本申请的任一产品或方法并不一定需要同时达到以上所述的所有优点。
附图说明
[0018]为了更清楚地说明本申请或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
[0019]图1为本申请实施例2中5个待测样品扩增得到的PCR产物的凝胶电泳结果图；
[0020]图2为本申请实施例3中各待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花的ASV序列数目比与各待测样品中金银花和灰毡毛忍冬的花质量比的相关性分析结果图；
[0021]图3为本申请实施例4中10个待测样品扩增得到的PCR产物的凝胶电泳结果图。
具体实施方式
[0022]下面将结合本申请中的附图，对本申请中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种引物组合物，包括正向引物和反向引物；其中，所述正向引物的序列如SEQ ID NO:1所示，所述反向引物的序列如SEQ ID NO:2所示。2.权利要求1所述的引物组合物在鉴定金银花及其混伪品中的应用；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。3.一种采用权利要求1所述的引物组合物鉴定金银花及其混伪品的方法，其特征在于，包括步骤：提取待测样品的总DNA；采用所述引物组合物，以所述待测样品的总DNA为模板进行PCR扩增；对扩增产物进行测序，获得ASV序列；将所述ASV序列与金银花及其混伪品的psbA
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trnH区域内相应基因序列进行比对，鉴定出金银花及其混伪品；其中，所述混伪品包括灰毡毛忍冬的花、红腺忍冬的花、华南忍冬的花、黄褐毛忍冬的花和淡红忍冬的花中的至少一种。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增体系中包括：0.1
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0.3μmol/L正向引物；0.1
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0.3μmol/L反向引物；2
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10ng/μL模板DNA；50
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150μmol/L dNTPs；0.02
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0.03U/μL DNA聚合酶。5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件包括：预变性：97
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98℃，50
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70s；变性：97
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98℃，8
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12s；退火：54
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56℃，13
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17s；延伸：67
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69℃，25
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35s；35
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45个循环；完成循环后继续67
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69℃延伸4
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6min。6.一种采用权利要求1所述的引物组合物定量鉴定金银花及其混伪品的方法，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：田晓轩，张小英，徐流巍，王文秀，杨文志，吴红华，张鹏，李雪，王跃飞，王彧，陈璐，王丹，刘梦扬，
申请(专利权)人：天津中医药大学，
类型：发明
国别省市：